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肾和肺的去细胞器官支架体外灌注制备方法的优化
研究采用体外灌注法制备肾和肺去细胞器官支架的优方法.将10只成年SD雄鼠作为器官支架供体,进行去细胞器官支架制备,不同器官采用不同血液循环方法进行体外大气压灌注(基于大气压力往循环体系中注入)0.75％ SDS、1％ Triton X-100、0.1％H2O2制备器官去细胞支架,通过HE染色、DAPI荧光染色方法检测去细胞程度,通过扫描电镜观察其结构脉络网和去细胞程度,通过阿利新蓝-过碘酸雪夫氏染法(AB-PAS)、Masson染色、免疫组化染色方法检测去细胞器官支架的成分保留.结果表明,采用体外大气压灌注法制备的去细胞器官支架能有效去除细胞,且糖原、胶原、纤连蛋白(Fibronectin)、弹性蛋白(Elastin)、层粘连蛋白(Laminin)、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)等有效保留,同时支架能保持良好的结构脉络网.通过大气压注入去细胞化试剂,能有效保留良好的结构脉络网,同时达到有效的去细胞程度(去细胞程度大于99％),且营养成分能有效保留.
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去细胞化技术在全肝生物支架建立中的应用
目的 通过去细胞化技术建立保留细胞外基质的完整肝脏支架,并对支架进行形态结构和保留成分鉴定.方法 通过门静脉插管,依次灌注去垢剂曲拉通X-100(Triton X-100),十二烷基硫酸钠(SDS),并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱残留去垢剂,对所得支架进行HE染色、门静脉及月日道铸型、扫描电镜、纤维成分染色鉴定等形态学观察.并将支架切成50 μm的厚度后与C3A细胞系共培养,进行生物相容性验证.结果 经本实验方案得到肝脏生物支架的成功率为75%.肝脏生物支架包膜完整,肉眼可见肝脏内Gllisson管道结构.HE染色示无细胞及胞核残存.管道铸型见胆道、门静脉完整,无铸型液溢出.扫描电镜示大量纤维网状结构存在.纤维成分染色见大量胶原纤维、弹力纤维存在.生物相容性实验初步显示该支架具备较好的生物相容性,可以作为生物支架材料应用.结论 经本实验去细胞化过程,肝组织细胞可从细胞外基质中完全洗脱下来,并保留比较完整的肝脏管道系统.本研究获得全肝生物支架可以作为肝脏器官培养的基础支架.
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聚乙二醇在猪组织工程瓣膜制备中的应用
目的:观察聚乙二醇法在组织工程瓣膜准备中的应用价值,比较聚乙二醇去细胞前后组织工程瓣膜的物理特性.方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学系实验室完成.①实验分组:取猪10只,由于猪主动脉瓣为三叶瓣结构,共取得瓣叶组织30个,麻醉后宰杀取其心脏动脉瓣膜,分为去细胞组和对照组,每组各15个.②实验方法:去细胞组用聚乙二醇和DNase Ⅰ处理;瓣叶组织放入1 kg/L聚乙二醇,室温下浸泡30～45 min,振荡器加以振荡;含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24 h,反复3次洗脱;以5×104 U/L DNase Ⅰ液浸泡处理1 h;对照组仅以含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24 h,反复3次洗脱.③实验评估:苏木精-伊红染色、扫描电镜观察去细胞情况,吸光度(A)值,计算去细胞率(%)=(对照组A值-去细胞组A值)/对照组A值×100%.猪去细胞瓣膜条置于力学测试仪测定大负荷、大应力、大应变和弹性模量.结果:纳入猪10只,均进入结果分析.①去细胞组织形态学观察:去细胞组猪瓣膜组织中看不到细胞成分,且细胞外基质结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结构清晰,组织无明显水肿.②DNA含量分析:聚乙二醇处理后去细胞百分率为95.32%.③生物力学检测:与对照组比较,去细胞组瓣膜组织大负荷[(12.586±1.693),(10.242±1.435)N,P＞0.05]、大应力[(2.346±0.342),(1.877±0.572)N/mm,P＞0.05]、弹性模量(15.152±1.579,14.549±0.678,P＞0.05)、大应变[(31.685±7.533),(28.118±6.045)mm/N,P＞0.05]等均无显著差异.结论:聚乙二醇法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,对组织机械性能无明显影响,适于构建组织工程瓣膜.
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去细胞化全肝生物支架循环灌注培养条件下体外细胞再植
背景:通过去细胞化技术制备全肝生物支架成为缓解供体短缺的新技术,优化肝脏组织的去细胞化流程成为新的课题.目的:通过去细胞化技术建立完整保留肝脏三维结构和脉管系统的全肝生物支架,利用自主设计的循环灌注培养装置实现生物支架体外细胞再植.方法:通过门静脉路径循环灌注去垢剂Triton X-100,十二烷基硫酸钠,并用磷酸盐缓冲液洗脱残留去垢剂.通过动态循环灌注培养装置进行支架与HepG2细胞的共培养,观察植入细胞在全肝生物支架内的功能表达.结果与结论:经去垢剂灌注后,支架呈现保持肝脏三维结构的透明结构,苏木精-伊红染色以及扫描电镜结果显示细胞成分被完全移除,Masson's Trichrome染色可见大量胶原纤维,免疫组化结果证实纤维连接蛋白和层粘连蛋白保存完整.循环灌注培养下细胞白蛋白表达量及尿素合成量较平板培养明显提高.说明去细胞化肝脏生物支架可作为体外肝脏组织重建的基础材料,动态循环灌注方法可实现支架中细胞再植.
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一种新型大鼠胰腺去细胞化支架的制备研究
目的 通过经胃左动脉途径灌注,选择胰腺体尾部作为灌注主体,应用各种去细胞化灌注技术,以制备新型天然胰腺去细胞化生物支架,并全面评价其理化特性,以期为胰腺组织再生工程的研究提供良好的应用载体.方法 选择健康成年雄性SD大鼠,离体获取胰体尾部作为灌注主体,采用胃左动脉作为灌注入路,通过物理冻融、酶解法及曲亚通(TritonX-100)为主辅以十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱剂组合进行顺行灌注,获取胰腺去细胞支架.并通过大体形态观察、美兰染色、组织病理学观察、基因组DNA定量分析、电镜观察、胶原蛋白成分鉴定、免疫原性分析等对去细胞化后的胰腺支架进行全面的评价.结果 本研究方法可成功制备肉眼透明的胰腺去细胞化支架,组织学检测和电镜观察均表明去细胞支架内无细胞残留,内部脉管网络和空间结构保存完整;免疫荧光分析表明去细胞化后支架的细胞外基质成分保留得较为完整,且支架DNA残留量为(42.3±10.6)ng/mg,不足正常胰腺的5%;皮下移植实验证实获得的去细胞化支架具有良好的组织相容性.结论 以胰腺体尾部作为灌注主体,经胃左动脉途径灌注的策略能够成功制备一种新型的去细胞化胰腺支架,并且支架的基质成分和理化特性较完整地保留,能够为胰腺组织工程研究提供一种良好的载体选择.
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大鼠子宫去细胞化支架的制备和评价
目的:通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体.方法:选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通(TritonX-100)联合十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架.并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价.结果:成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为(45.6±7.3)ng/mg,不足正常子宫的5%(P<0.01),美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的(0.57±0.12)μg/mg增加到去细胞化子宫支架的(0.88±0.10)μg/mg,差异有统计学意义(P<0.05),结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性.结论:本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体.
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聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性
目的 探讨聚乙二醇(PEG)法在生物带瓣管道准备中的应用价值,比较PEG去细胞前后带瓣管道的物理特性.方法 猪主动脉瓣带瓣管道分为去细胞组和正常对照组,去细胞组用PEG和Dnase Ⅰ处理,苏木精-伊红染色观察去细胞情况,DNA含量测定,计算去细胞百分率;猪主动脉带瓣管道条置于力学测试仪,测定大负荷、大应力、大应变和弹性模量.结果 PEG组去细胞百分率为95.32%,去细胞猪带瓣管道组织中看不到细胞成分;且细胞外基质(ECM)结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结构清晰,组织无明显水肿.生物力学检测,与对照组比较大负荷、大应力、弹性模量、大应变等的差异均无显著性意义.结论 PEG法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,对组织机械性能无明显影响,适于构建组织工程带瓣管道.
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选择适宜的灌注去细胞方法应用于全肝脏去细胞支架的制备
目的：对比低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）和1％ Triton X-100对制备大鼠肝脏去细胞支架（DLBS）的影响，建立一种简单且适宜的DLBS的制备方法。方法将低浓度SDS（0．25％、0．50％）和1％ Triton X-100分别加入大鼠肝脏去细胞流程，通过免疫荧光及扫描电子显微镜观察支架结构，并对支架内成分进行定量分析，再通过四氮唑盐比色法（MTT ，Assay）观察支架对C3A的细胞毒性。结果 0．25％ SDS和0．50％ SDS处理组的DNA定量均小于50 ng／mg干质量，并且糖胺聚糖在0．25％SDS和1％ T riton X-100处理组的定量要高于0．50％ SDS处理组。同时，M T T 实验表明3种方法处理后的去细胞支架对于C3A细胞的生长无毒性作用。结论应用0．25％ SDS在5 mL／min灌注流速下去细胞能够制备更为理想且有效的DLBS ，从而为器官再生打下基础。
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去细胞化支架材料肝素化修饰及抗凝性能研究
本文旨在通过对去细胞化天然材料进行肝素化修饰,改善其作为组织工程支架材料的抗凝血性能.本文以猪肝去细胞化材料为研究对象,对材料分别进行了层层自组装(LBL)肝素化修饰、多点连接(MPA)肝素化修饰或末端连接(EPA)肝素化修饰,然后检测它们的肝素化效果及抗凝血性能.结果表明,三种肝素化修饰材料的抗凝血性能与未经处理的去细胞化材料相比均有显著提高,其中EPA修饰肝素化材料的凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)均超过检测仪器大值.同时,EPA修饰肝素化去细胞化材料修饰时间短,肝素释放慢,复钙时间长.本研究结果显示EPA肝素化修饰的去细胞化材料获得了良好的抗凝血性能.
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立体培养技术制造器官
人类可移植器官短缺的问题一直未能解决,体外再造人体器官的探索也一直没有停止.目前人们已可以在体外通过立体培养方法得到有功能的器官或是类器官.不同于传统的平面培养,立体培养可以使细胞与周围细胞或组织环境产生联系,形成立体的、相互紧密连接并通信协作的组织结构,进而共同发育形成器官.这为人类器官的体外再造提供了新思路.本文对现有的立体培养方案进行了分类叙述、分析及总结,并对下一步的发展进行了展望.
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牙周韧带细胞膜片技术用于牙周组织再生的研究进展
为了解决中重度牙周炎引发的牙周组织破坏后无法自主再生的问题,细胞膜片工程根据引导性组织再生术的基本原理,通过将使用温敏培养皿等方法获取的完整细胞片层直接移植贴附到缺损部位的方法,实现获取牙骨质、牙槽骨及嵌入二者的牙周韧带同时再生的目标.近年来,细胞膜片技术不断发展,逐步克服了单层细胞膜片厚度偏低、血管化不良及自体细胞来源不足等问题,其中运用牙周韧带细胞膜片进行牙周组织再生已经正式进入临床试验阶段.本文对近年来牙周韧带细胞膜片及其他常用细胞膜片在牙周组织再生方向应用的新进展作一综述.
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去细胞化肝脏生物支架的应用进展
肝脏替代治疗是目前终末期肝病有效的治疗措施,而去细胞化肝脏生物支架拓宽了肝脏替代治疗的研究领域.目前普遍的支架制备过程是在一定的物理条件下,经灌注设备将化学试剂(去垢剂、消化酶等)注入肝脏自身的脉管结构中,达到去除细胞成分,保留支架内ECM和超微脉管结构的目的.再将种子细胞注入到去细胞化肝脏生物支架,获得再细胞化肝脏,模拟机体内肝脏生物环境进行体外或体内培养,观察种子细胞附着情况,检测肝脏代谢功能,评估肝脏替代效果.目前,种子细胞的选取、再细胞化流程、再细胞化肝脏移植等问题仍处于探索阶段.笔者围绕去细胞化肝脏生物支架的制备与评价、检测和应用作一综述,为进一步应用于实验研究和临床实践提供参考.
