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人血小板冻干前海藻糖负载技术的优化
本研究以建立血小板负载海藻糖基本技术为基础,进一步优化海藻糖负载技术,包括负载温度、负载时间、海藻糖负载浓度和负载溶液.通过比较缓冲液和血浆负载效果,比较生理温度(37℃)和相变温度(16℃)下血小板胞内海藻糖浓度与负载时间曲线、血小板平均体积(MPV)与负载时间、海藻糖负载浓度的曲线、计算海藻糖的负载率,优选负载率较高的负载溶液、负载温度、负载时间和海藻糖浓度等血小板海藻糖负载技术参数.结果表明:37℃血浆负载率高于缓冲液负载率,且血浆负载4小时,在37℃海藻糖负载率可高达19.51%,明显高于16℃的负载率6.16%;血小板MPV在16℃比在37℃明显增大43.2%,随海藻糖负载时间(1-4小时)延长和负载浓度(0-100mmol/L)增加未见明显改变;血小板MPV在37℃与海藻糖负载时间和负载浓度呈正相关性,且海藻糖负载时间与负载浓度存在协同效应,海藻糖负载浓度高于50 mmol/L,MPV随浓度(0-100mmol/L)、负载时间(1-4小时)增加而增大.结论:在原血浆中负载海藻糖、温度37℃、时间4小时、浓度低于50 mmol/L可以作为优化后血小板海藻糖负载技术基本参数,负载浓度需根据冻干保存需要进行调整.
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人血小板冻干前负载海藻糖技术研究
目的建立血小板负载海藻糖基本技术,包括负载温度,负载时间和海藻糖负载浓度.方法通过比较生理温度(37℃)和相变温度(16℃)下血小板胞内海藻糖浓度与负载时间曲线,血小板平均体积(MPV)与负载时间、海藻糖负载浓度曲线,优选负载率较高的负载温度和负载时间.在此基础上,做海藻糖负载浓度与血小板胞内浓度关系曲线,并计算海藻糖负载率,确定血小板负载海藻糖基本技术.结果 37℃海藻糖负载率明显高于16℃负载,37℃负载4h海藻糖负载率高达11.6%, 16℃负载4h海藻糖负载率为5.6%;血小板MPV在16℃比37℃明显增大43.2%,但随负载时间和负载浓度改变不发生明显改变;37℃条件下负载,血小板MPV变化与负载时间和海藻糖负载浓度呈现正相关性,且负载时间与海藻糖负载浓度存在协同效应,海藻糖负载浓度低于50mM,负载时间在1h～4h内,MPV没有明显变化,高于50mM,随浓度、负载时间增加而增大;37℃,4h负载海藻糖,海藻糖负载浓度为45mM时,负载率高达13.86%.结论负载温度37℃,负载时间4h,负载浓度45mM可以作为血小板海藻糖负载基本技术参数,负载浓度可根据冻干保存需要进行调整.
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冻干保存血小板可逆性抑制激活的实验研究
目的 探索优的血小板激活抑制剂组成方案,以建立一套完善的血小板冻干前处理程序.方法 选择已基本确定有效作用浓度的6种血小板激活抑制荆如前列腺素E1、腺苷、左旋精氨酸、植酸钠、百维利肽和西洛他唑,结合血小板冷冻干燥保护剂的负载过程,以CD62p、PAC-l、MPV和Plt作为血小板活化指标,CD62p和PAC-l的再表达率作为血小板反应性指标,诱导剂诱导的血小板大聚集率和SPAT作为血小板聚集和促凝血功能的指标;采用正交实验设计,分8个实验组,研究分析各因素在负载中对血小板状态和功能的影响,选择优的负载液组成.结果 A因素(负载环境)水平Ⅰ在抑制血小板MPV增大、D62p和PAC-l的表达以及再表达率保留、血小板大聚集率和SPAT影响均优于水平Ⅱ(P均＜0.05);B因素(PGEI)C因素(左旋精氨酸)F因素(植酸钠)G因素(百维利肽)的水平Ⅱ则均由于各自的水平Ⅰ.因此,在8个实验条件中,以第3实验组(A1B2C2D1E1F2G2)对血小板功能保护的好.结论 在血小板冻干前保护剂负载过程程序,在血浆负载环境中添加1μmol/L前列腺素E1,5μmol/L左旋精氨酸,0.5 mmol/L植酸钠和0.5μmol/L百维利肽,可有效抑制血小板激活,使保存的血小板具有表达CD62p和PAC-l活性、聚集反应和促凝血活性.
