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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化
为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTr法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性.结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀.在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白.但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过NiNTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物.根据这一特性,经反复筛选实验设计终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白.所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%.Western -blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTr生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用.结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞.
关键词： 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 蛋白纯化 靶向杀伤 生物活性 -
新型重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化
目的:对高效表达的重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化.方法:对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性,经离子交换层析.结果:工程菌HB101/pE01T的表达产物是以包涵体形式存在,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后,再超声破碎效果好;包涵体的洗涤则先用Triton-X-100洗2次,再用8 mol/L尿素洗涤一次效果更优;佳变性条件为在7 mol/L盐酸胍中加入 0.065 mmol/L的DTT和0.2 mol/L的盐酸精氨酸;佳复性条件为在10℃复性保持24 h,蛋白浓度保持在30～ 80 μg/ml,并需加入0.2 mol/L盐酸精氨酸;利用谷胱甘肽的氧化还原法,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶ 1时所获得的活性成分得率高;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为95%的目的蛋白,所得融合蛋白可与IL-6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL-6R的人多发性骨髓瘤细胞.结论:本研究获得重组IL-6 D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线.
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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化
目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白.方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索.结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE菌种的佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1 mmol/L IPTG,诱导12 h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%.结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础.
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具有靶向免疫抑制作用新型重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL真核表达载体的构建及其生物效应
目的:构建B7-2-PE40KDEL的真核表达载体,探讨通过体内表达重组融合蛋白,特异性杀伤高表达CD28 T细胞,阻断B7∶CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受的可能性.方法:以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL.利用RT-PCR、Western 印迹及ELISA法从mRNA、蛋白质水平检测了B7-2-PE40KDEL在RPE-CHO真核细胞中的表达情况.采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28 T细胞的生物活性进行测定.结果:成功构建了pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL真核表达载体,转染入RPE-CHO细胞后可转录翻译为重组融合毒素蛋白,相对分子质量约为71×103,平均106个转染细胞24 h表达0.23 μg/L.活性测定显示真核载体所表达的B7-2-PE40KDEL可特异性地抑制高表达CD28的人T淋巴细胞系,而对CD28阴性的人白血病细胞系的抑制率较低.结论:真核载体表达的B7-2-PE40KDEL具有良好的靶向性免疫抑制活性,为进一步开展其体内特异性防治移植排斥反应及自身免疫性疾病奠定了基础.
关键词： 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 真核表达载体 免疫耐受 -
新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部分表征的鉴定
目的:对构建的新型重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定.方法:采用SDS-PAGE相对分子量、胰蛋白酶消化的MALDI-TOF-MS质谱、蛋白印迹、全波长扫描和MTT法分别测定该融合蛋白相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性.结果:B7-2-PE40KDEL经12%SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对分子量为72 628,与理论预测值69 561相比误差在5%之内;全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225 nm和276 nm处各有一吸收峰;MALTI-TOF-MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为60 000～80 000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合蛋白为全新蛋白,与我们预测的目的蛋白相符;Western blot实验显示B7-2-PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT杀伤活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28+的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤,而对不表达的CD28-淋巴细胞系Raji无任何杀伤.结论:重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7:CD28细胞杀伤活性的蛋白质.
关键词： 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 肽谱 抗原特异性 生物学活性
