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β-catenin特异性抑制剂XAV939对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制的实验研究
目的:通过短发夹RNA (shRNA)干扰β-catenin基因的表达及使用β-catenin特异性抑制剂XAV939作用于套细胞淋巴瘤(MCL) Jeko-1细胞株,了解特异性抑制β-catenin活性对Jeko-1细胞增殖及细胞凋亡的影响.方法:将构建β-catenin shRNA真核表达载体转染Jeko-1细胞,应用RT-PCR和Western blot的方法鉴定干扰效果,用不同浓度XAV939处理MCL细胞株Jeko-1;应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、CyclinD1、C-MYC、caspase-3表达水平的变化.结果:shRNA转染48 h后,RT-PCR、Western blot检测发现,Jeko-1细胞的β-catenin的mRNA、蛋白表达下降;无论使用shRNA或抑制剂处理,均可抑制Jeko-1细胞增殖,促进其凋亡;Western blot检测显示,凋亡相关蛋白BCL-2、CyclinD1、C-MYC的表达下降,而BAX、caspase-3表达上升.结论:特异性抑制β-catenin活性能有效地抑制Jeko-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡.
关键词： 短发夹核糖核酸 XAV939抑制剂 β-连环素套细胞淋巴瘤 细胞凋亡 -
短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应
目的 研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2) UL54基因的干扰效应.方法 针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(sh-RNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组(阴性对照组)及不加任何重组表达载体的空白对照(空白对照组).重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度.结果 荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA 1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平(P均＜0.01);对UL54基因的抑制率在阴性对照组(加shRNA NC)、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7％、69％、56％及55％,以shRNA 1081组为高.终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降(P均＜0.01).结论 成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制.
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有效PGK1短发夹RNA序列的筛选
目的 筛选有效抑制磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因的短发夹核糖核酸(shRNA)序列.方法 针对PGK1的不同基因区域设计4个shRNA序列,应用LipofectamineTM 2000方法转染至胶质瘤细胞株U251细胞,荧光显微镜下观察shRNA的转染效率.采用RT-PCR方法检测PGK1的mRNA表达,Western blot方法检测PGK1的蛋白表达.结果 针对PGK1-homo-441位点的shRNA4(5'-GCAAGGATGTTCTGTTCTTGA-3')能更有效地抑制PGK1的mRNA及蛋白表达.结论 shRNA4是能有效抑制PGK1表达的序列,可用于PGK1的功能研究.
关键词： 短发夹核糖核酸 磷酸甘油酸激酶1基因 -
靶向生存素基因的shRNA抑制膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长
目的 观察稳定转染靶向生存素(survivin)基因短发夹RNA(shRNA)对膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 将靶向生存素基因的shRNA真核表达载体转染人膀胱癌细胞T24并获得稳定的单克隆细胞,实时定量PCR检测转染后生存素mRNA表达的变化;分别将转染和未转染细胞种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;通过免疫组化检测肿瘤组织生存素蛋白表达的差异.结果 RNA干扰使T24细胞生存素表达下调92.86%;未转染组在20～29 d均形成体积超过2000 mm3的肿瘤,转染组在43 d时经病理证实3只裸鼠形成肿瘤,大体积62.5 mm3;免疫组化显示转染组形成的肿瘤生存素蛋白表达明显减弱.结论 靶向生存素基因的shRNA明显下调了生存素表达,并抑制了膀胱癌细胞T24裸鼠移植瘤的生长.
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MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定
目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2.方法根据人MeCP2 mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定.结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入.结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/I和psilence-MeCP2/Ⅱ.
