首页 > 文献资料
-
GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用
引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段.设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶.通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础.
-
贫困山区早孕期HCMV宫内感染与UL54基因突变的研究
目的: 探讨贫困山区早孕期人巨细胞病毒(HCMV)宫内活动性感染与HCMV UL54基因突变的关系.方法:采用免疫组织化学(SABC)PCR-RFLP的方法检测人绒毛组织中HCMV早期抗原的存在及HCMV UL54基因密码子501是否发生突变.结果:贫困山区早孕期妇女HCMV宫内活动性感染率为18.91%;PCR-RFLP分析结果显示,在早孕期HCMV宫内感染者中UL54 501密码子未发生突变.结论:贫困山区早孕期HCMV宫内感染与HCMV UL54基因密码子501突变无关,但不排除其他位点的突变或其他形式异常导致病毒致病性改变存在的可能性.
-
人巨细胞病毒在免疫力低下人群中耐药研究新进展
随着抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的进展,更昔洛韦(ganciclovir,GCV)等抗病毒药物对HCMV感染引起的相关疾病有较好的疗效,其他多种新型抗病毒药物也着手于体内外的各项试验.抗病毒药物治疗HCMV病外,更大用途是预防感染症状的发作.因为人群中HCMV感染是普遍的,且又呈现潜伏感染状态,一旦宿主免疫功能受损失控,潜伏.激活感染的危害是严重的.
-
短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应
目的 研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2) UL54基因的干扰效应.方法 针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(sh-RNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组(阴性对照组)及不加任何重组表达载体的空白对照(空白对照组).重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度.结果 荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA 1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平(P均＜0.01);对UL54基因的抑制率在阴性对照组(加shRNA NC)、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7％、69％、56％及55％,以shRNA 1081组为高.终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降(P均＜0.01).结论 成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制.
-
融合蛋白表达质粒pUL54S-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达
目的 探讨构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54(UL54S)基因融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pUL54S-EGFP转染人胚肾293细胞,瞬时表达UL54S和EGFP的可行性.方法 采用PCR法扩增UL54s基因并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,采用脂质体法转染AD293细胞后通过荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的表达情况.结果 重组质粒pUL54S-EGFP转染AD293细胞12h后即可见到荧光蛋白的表达,至48h表达达高峰;转染48h pUL54S-EGFP组平均转染率为47%.平均荧光强度为547.结论 重组质粒pUL54S-EGFP可在人胚肾293细胞内瞬时表达UL54S和EGFP融合蛋白,EGFP的表达可报告UL54基因的表达,质粒pUL54S-EGFP构建成功.
-
RNase P核酶对人巨细胞病毒UL54基因mRNA体外切割作用
外部引导序列(EGSs)是mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段.我们设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus) UL54基因mRNA序列互补的EGSs,将其与大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA构建成M1GS核酶.通过对UL54基因亚克隆片转录产物体外切割研究,证实该核酶具备对UL54 mRNA片段的特异切割能力,可以发展成为一种抗病毒试剂.
关键词： 人巨细胞病毒HCMV ul54基因 RNase P 外部引导序列 -
人巨细胞病毒耐药性的研究进展
抗人巨细胞病毒(HCMV)的治疗药物主要有更昔洛韦(GCV)、膦甲酸钠(FOS)和西多福韦(CDV).但近年来,其耐药株呈增多趋势,主要的耐药机制为病毒UL97基因和UL54基因发生了突变.根据耐药株出现的时间和高危因素,可采用表型和基因型方法进行检测,以利于HCMV感染的及时监测并采取相应的处理措施.
-
桥序列在构建人工核酶M1GS中的作用
目的:为检验连接的GS序列是否会影响M1RNA高级结构而导致M1RNA活性改变,对核酶的催化机制进行探讨.方法:通过软件模拟对M1GS进行结构分析,筛选了一段独立折叠的桥序列连接M1RNA与GS,并通过体外切割实验检验有桥和无桥序列的核酶的活性.结果:有桥序列的M1GS具备体外特异切割底物的核酶活性,而无桥序列的M1GS核酶未表现体外切割活性.结论:证实桥序列对维持M1RNA高级结构和保持人工核酶M1GS的体外切割活性具有重要作用.
-
双shRNA表达载体对HSV-2复制的干扰作用
目的 利用带有多个启动子的质粒pGenesil10-3p,构建针对HSV-2靶基因UL27和UL54的双短发卡RNA(Duo-shRNA)表达载体,探讨双shRNA表达载体对双靶基因的干扰作用以及对HSV-2病毒增殖的影响.方法 Duo-shRNA通过脂质体转染HEK293细胞后接种HSV-2,采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,终点滴定法检测细胞上清液中病毒滴度,QPCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测对靶基因mRNA的抑制率,蛋白质印迹(Western blot,WB)检测靶蛋白的表达量.结果 结果表明Duo-shRNA对于细胞存活率、抑制HSV-2复制以及干扰靶基因表达方面都优于单-shRNA,可以达到多个单基因-shRNA联合作用的干扰效果.结论 利用双启动子的方法构建了针对HSV-2的UL27和UL54的shRNA质粒表达载体,更好的抑制HSV-2病毒靶基因mRNA表达水平以及病毒在HEK293细胞中增殖,实现了多个单基因的shRNA干扰效应的相互作用.
-
UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响
目的 利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响.方法 采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率.结果 转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.01).与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率(P＜0.01),增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达(P＜0.01).结论 pG-PU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率.
