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新生大鼠神经干细胞球体外生长传代及分化鉴定
近年来,有关神经干细胞分离培养和研究已经成为神经生物学研究的热点.已有许多研究小组报道了大鼠、小鼠和人胚胎脑组织神经干细胞的分离和培养方法[1-3],但对新生大鼠的脑组织神经干细胞进行分离传代培养则鲜有报道.由于神经干细胞可作为一种移植手段治疗神经系统各种病变和损伤,还可用于研究不同生长因子对神经干细胞的体外发育的影响,其有着广泛的应用前景.因此,我们实验室利用新生当天大鼠大脑皮质和中脑进行神经干细胞的分离培养取得成功,现报道如下.
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神经干单细胞获得的一种方法
目的 寻找一种有效获得神经干细胞单细胞的方法.方法 运用胰蛋白酶,EDTA和不同浓度酵素对人胚神经干细胞球进行消化,免疫细胞化学染色鉴定及其分化.结果 运用一定浓度的酵素可以获得大量成活的单个神经干细胞.而运用胰蛋白酶,EDTA消化后成活细胞少.结论 运用一定浓度的diapase消化神经干细胞球是可获得大量成活的神经干细胞单个细胞的方法.
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胚胎小鼠听皮层区域神经干细胞的分离培养及鉴定
目的 通过剖腹手术从C57BL/6胎鼠(El4左右)中获得听皮层区域组织,进行神经干细胞体外培养和分化鉴定,探索新的自体NSC移植治疗来源.方法 选取孕14天左右的C57BL/6小鼠,剖腹取出胎鼠,分离听皮层区域组织,在体外无血清培养得到NSC,用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物(Nestin)、增殖能力(BrdU)及多向分化潜能的鉴定.结果 听皮层区域组织在体外通过无血清培养能够得到大量细胞球,经Nestin及Brdu鉴定为NSC球且具有较高增殖能力.NSC球在体外分化后产生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)阳性的神经元以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞.结论 胎鼠听皮层区域在体外无血清培养可获得大量具有增殖能力和多向分化潜能NSCs,是自体NSCs移植治疗新的种子来源.
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重组腺相关病毒转染神经干细胞球的实验研究
目的:探讨重组腺相关病毒2型(rAAV2)对神经干细胞球的转染能力.方法:①将FITC标记的rAAV2(FITC-rAAV2)分成两组,A组直接与神经干细胞球混合,B组与肝素混匀后再与神经干细胞球混合,孵育30 min后在荧光显微镜下观察;②含有GFP报告基因的rAAV2(rAAV2-GFP)与神经干细胞球孵育30 min后,分成两组:A组继续在培养箱内培养,B组分散成单细胞后移植到大鼠脑内,一个月后分别在荧光显微镜下观察神经干细胞球和大鼠脑组织切片中报告基因的表达情况;③将含有低氧启动子(低氧应答元件,HRE)、VEGF和GFP的rAAV2(rAAV2-HRE-VEGF-GFP)转染神经干细胞球后分为两组:A组在低氧条件下培养,B组在常规条件下培养,72 h后观察报告基因的表达情况.结果:①FITC-rAAV2转染神经干细胞球的结果:A组有明亮的绿色荧光,B组基本无绿色荧光;②rAAV2-GFP转染神经干细胞球后一个月,A、B两组均可以看到绿色荧光;③rAAV2-HRE-VEGF-GFP转染神经干细胞球后72 h,A组可见绿色荧光,B组无绿色荧光.结论:rAAV2可以与神经干细胞球特异性结合,rAAV2携带的外源基因在体内和体外均可以有效表达,rAAV2携带外源基因的表达可以人为调控.
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硒化合物对大鼠神经干细胞球分化成熟蛋白表达的影响
[目的]观察微量元素硒对神经干细胞分化成熟的影响.[方法]利用新生大鼠神经干细胞体外培养技术、小盖玻片培养法和免疫细胞化学方法,观察了无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒甲基半胱氨酸)对神经干细胞向神经元分化标记蛋白NSE、星形胶质细胞分化标记蛋白GFAP、少突胶质细胞分化标记蛋白CNPase的表达状况,同时用Western-blot免疫印迹技术对神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、β-微管蛋白(β-tubulin)、星形胶质细胞-醋酸纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、环核苷酸-3'磷酸水解酶(2',3'-cyclic nucleotide3'phosphohydrolase,CNPase)进行了半定量分析.[结果]适量浓度的硒对神经干细胞球的分化发育有良好的促进作用.在含硒的营养液中神经干细胞分化好、形态正常.神经干细胞向神经元、神经胶质细胞方向分化比例较高.其中胶质细胞分化方向GFAP+和CNPase+细胞计数,平均每高倍视野分别为5～6个和7～12个;并且分支多、细长,网络复杂.免疫印记结果发现有机硒能明显促进神经干细胞分化成熟蛋白NSE、β-tubulin、GFAP、CNPase的表达,化学发光显影明显高于对照组.[结论]适量的硒能促进神经干细胞的分化成熟.特别是硒甲基半胱氨酸是一个低毒和高生物效应的硒营养制剂,在神经干细胞球体外分化发育中有着重要的作用.
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EGF对神经干细胞迁移的影响
目的研究表皮生长因子(EGF)对神经干细胞迁移的影响.方法取孕13～14 d SD大鼠胚胎纹状体行神经干细胞培养,7 d后取悬浮神经球制成单细胞悬液再培养,EGF作用下连续培养14 d后分为实验组和对照组,继续培养,观察EGF对神经干细胞迁移的影响.结果原代培养的细胞球是神经干细胞,EGF传代培养14d时细胞球大小约100个细胞左右,实验组观察到第14d细胞球增殖变慢,细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触,14～17 d观察到神经干细胞迁移,17 d后细胞迁移现象消失;对照组中未观察到细胞迁移.结论EGF在某一特定时间内能够诱导神经干细胞迁移.
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SD大鼠胚胎神经干细胞悬浮培养与鉴定
目的:研究神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法.方法:以孕12.5 dSD胚胎鼠端脑为组织来源,应用无血清悬浮培养技术培养、扩增NSCs;NSCs传代2次后,应用Nestin免疫荧光检测NSCs的干细胞特性,BrdU标记法检测细胞增殖能力;诱导贴壁分化后,对分化细胞进行NSE、GFAP免疫荧光鉴定;扫描电镜观察神经球及单个细胞表型.结果:培养出大量悬浮生长的NSCs球,Nestin及BrdU表达阳性;神经球诱导分化后表达NSE、GFAP,表明NSCs可分化为神经元和星形胶质细胞;HE染色可见NSCs细胞核巨大,胞质较少;扫描电镜可观察到单个NSC表面较光滑,且神经球表面的NSCs连接较疏散.结论:应用无血清培养技术体外培养扩增出的胚胎神经干细胞具有自我更新和多向分化能力,经诱导后可分化为神经元和星形胶质细胞.
