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S和M基因片段文献资料
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汉坦病毒84Fli株S和M片段基因克隆、序列分析及在真核细胞中表达的研究
目的克隆汉坦病毒84Fli株S,M片段,测定这些基因的核苷酸序列,用瞬时表达了解S和M片段在真核细胞中的表达.方法以我国分离的汉坦病毒84Fli株感染的Vero-E6细胞提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增其S及M片段的全长cDNA.然后将84Fli株的S,M片段cDNA基因分别克隆入pCR2.1-TOPO载体中,随机挑选其中的3个克隆测定核酸序列,确定汉坦病毒84Fli株S和M片段核苷酸序列.根据S和M片段核苷酸序列设计引物,PCR扩增S及M片段的编码区,构建了真核表达质粒pcDNA3/84SC及pcDNA3/84MC.用质脂体法把质粒转入COS7细胞,瞬时表达NP及G1和G2糖蛋白.用免疫荧光(IFA)、Western blot和免疫沉淀方法检测核蛋白及糖蛋白的表达.结果汉坦病毒84Fli株的基因组S片段长度为1 688个核苷酸,编码430个氨基酸.汉坦病毒84Fli株的基因组M片段长度为3 616个核苷酸,编码1 136个氨基酸.用免疫荧光(IFA)检测S和M片段在COS细胞中的瞬时表达为阳性.Western blot结果显示,存在有相对分子质量为50 000左右的核蛋白表达,免疫沉淀法显示有核蛋白、G1和G2糖蛋白的表达.结论 84Fli株病毒和其他汉滩病毒在核苷酸序列上虽有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍很高,成功地在COS7细胞中瞬时表达了汉滩病毒的核蛋白及糖蛋白.
