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mmu-miR-30b对鼠FoxO3 mRNA表达的影响
目的 探讨mmu-miR-30b与鼠FoxO3 (mFoxO3) mRNA的直接相互作用.方法 经生物信息学分析,利用特异性引物以及定点突变引物从鼠cDNA中分别扩增大小为402 bp、123 bp和299 bp的目的片段,并对123 bp和299 bp片段进行拼接,获得野生型、突变型mFoxO3 mRNA特异性片段,再分别与pmirGLO载体连接,构建野生型、突变型重组双荧光素酶报告基因质粒 (pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt);重组质粒与mmu-miR-30b/mmu-miR-30b inhibitor共转染至HEK293 T细胞,分析其荧光素酶活性;Western blot 分析mmu-miR-30b对mFoxO3翻译水平的调控作用.结果双酶切、琼脂糖凝胶电泳及测序技术结果显示pmirGLO-mFoxO3、pmirGLO-mFoxO3 mt被成功构建;共转染后,pmirGLO组、pmirGLO+mmu-miR-30b组、pmirGLO+mmu-miR-30b inhibitor组、pmirGLO-mFoxO3+mmu-miR-30b组、pmirGLO-mFoxO3+mmu-miR-30b+mmu-miR-30b inhibitor组和pmirGLO-mFoxO3 mt+mmu-miR-30b组的荧光素酶活性水平分别为13.18±0.97、14.35±0.99、12.46±1.20、9.55±1.11、13.71±0.89和10.99±0.92;与pmirGLO+mmu-miR-30b组相比,pmirGLO-mFoxO3+mmu-miR-30b组的荧光素酶活性被明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而pmirGLO-mFoxO3 mt+mmu-miR-30b组的荧光素酶活性无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05);与pmirGLO-mFoxO3+mmu-miR-30b组相比,pmirGLO-mFoxO3+mmu-miR-30b+mmu-miR-30b inhibitor组的荧光素酶活性有显著性增高,差异有统计学意义(P<0.05).加强mmu-miR-30b的表达能够显著抑制mFoxO3蛋白的表达(P<0.05),而削弱mmu-miR-30b的表达则显著增加mFoxO3蛋白的表达(P<0.05).结论 mFoxO3 mRNA是mmu-miR-30b的靶基因,两者之间存在着直接相互作用.
关键词： mmu-miR-30b 小鼠FoxO3 靶基因
