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抗CD71人-鼠嵌合抗体对活化淋巴细胞的效应
目的通过体外实验探讨抗CD71人-鼠嵌合抗体对活化淋巴细胞效应的影响,并与其鼠源性单克隆抗体进行比较.方法以丝裂原诱导的人外周血单个核细胞(PBMC)为靶细胞,测定嵌合抗体和鼠源性单抗对其增殖抑制率;在新鲜补体存在下,测定补体依赖性嵌合抗体介导的细胞毒效应(CDC).以EBV转化的B细胞为刺激细胞,测定两种抗体对其诱导的同种异体PBMC的增殖抑制率;以同种异体的PBMC为刺激细胞,测定两种抗体在单向、双向混合淋巴细胞培养(MLC)中的增殖抑制率.结果嵌合抗体和鼠源性单抗均可明显抑制丝裂原诱导的PBMC的增殖反应,且二者抑制率差异无显著性(P＞0.05),其抑制作用随抗体浓度增加而增强,PBMC和丝裂原共同孵育12 h后加入抗体的增殖抑制效应明显;在新鲜补体存在下,嵌合抗体对丝裂原诱导增殖的PBMC具有CDC作用,而鼠源性单抗CDC作用较弱;两种抗体对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用,且嵌合抗体组抑制率明显高于鼠源性单抗组(P＜0.05).结论抗CD71人-鼠嵌合抗体在体外实验中可抑制淋巴细胞的活化及其效应,其作用明显强于抗CD71鼠源性单克隆抗体.
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基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究
目的在CHO细胞中表达基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,并对其活性进行分析. 方法以质粒pcDNA5/FRT为骨架,应用pCI-dhfr1(本室构建并保存)的dhfr基因和hCMV启动子及SV40 polyA,构建了含有共扩增基因的哺乳动物双启动子表达载体,RT-PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因,与人IgG1轻重链恒定区基因融合后亚克隆到表达载体pA的多克隆位点,构建了表达质粒pA-HL, 脂质体转染CHO(dhfr-)细胞,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高MTX的浓度,筛选表达量高的克隆,扩大培养、收集上清,并纯化,纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western 印迹、抗原结合活性和微量细胞中和实验. 结果在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,表达量为5mg/L. 结论成功地在CHO(dhfr-)细胞表达了具有中和活性的基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础.
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抗CD71人-鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其机制探讨
目的研究抗CD71人-鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡的效应及其机制. 方法台盼蓝拒染法观察抗CD71人-鼠嵌合抗体对K562细胞生存的影响;细胞计数和MTT试验测定嵌合抗体及鼠源性抗体对K562细胞的作用;琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察K562细胞凋亡,以Annexin Ⅴ检测其凋亡率及进行细胞周期分析;并检测胞浆中细胞色素C和活化的caspase-8的相对含量. 结果抗CD71嵌合抗体及鼠源性抗CD71抗体均可抑制K562细胞的增殖作用,且二者抑制作用差异无显著性(P＞0.05).经琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察分别可见抗体诱导的K562细胞DNA梯形条带和细胞凋亡的形态改变,细胞周期分析可见其将细胞周期阻止在G1期,胞浆中细胞色素C含量增加而活化的caspase-8的含量不增加. 结论抗CD71人-鼠嵌合抗体可通过线粒体死亡途径诱导K562人红白血病细胞凋亡,其诱导凋亡可能与其干扰细胞铁离子转运有关.
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抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达
目的:表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体.方法:用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因,克隆人IgG1恒定区基因组基因,构建了轻重链嵌合基因和表达质粒pCdhfr1L,pcDNA3.1H,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达,MTX加压筛选表达量高的克隆,扩大培养收集上清并纯化,纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western 印迹检测和抗原结合活性的检测.结果与结论:在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌合抗体,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础.
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抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达
目的:构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体,并实现其真核表达.方法:从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中,转染 CHO细胞,实现其真核表达,并对抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定.结果:成功构建抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体,并实现其真核表达. 初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力.结论 :构建的抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想.
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抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的构建和表达
目的:构建抗CD71人-鼠嵌合抗体的真核细胞表达载体并在真核细胞中表达嵌合抗体.方法:将鼠源性抗CD71单抗(7579)重、轻链可变区基因(VH和VL)分别克隆至含有人IgG轻、重链恒定区的表达载体pγ-Expr和pκ-Expr中;将嵌合表达载体(Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr)经电转染技术共转染至真核细胞(SP2/0)中.结果:经ELISA法检验阳性转染瘤细胞培养上清,证明其表达蛋白产物中同时具有人IgG重链恒定区(Cγ)和轻链恒定区(Cκ)蛋白;通过间接免疫荧光流式细胞术(FCM)和间接免疫荧光显微技术,证明该表达产物能够特异性识别和结合表达于靶细胞表面的CD71分子.结论:抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)在体外真核细胞表达成功.
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抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达
目的：构建和表达抗TNF-α人-鼠嵌合抗体。方法：将抗TNF-α鼠单抗Z8的轻、重链可变区基因插入到含有人k链和IgG1重链恒定区基因的真核细胞表达载体中，分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人-鼠嵌合抗体真核表达载体，转染真核细胞，通过ELISA、RT-PCR、免疫印迹检测TNF-α的活性。用L929细胞检测嵌合抗体体外中和TNF-α的活性。结果：ELISA鉴定结果表明该嵌合抗体与TNF-α特异性结合；PF-PCR结果显示转染后细胞系有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录；免疫印迹结果证实有人IgG蛋白的表达；体外中和实验证明此嵌合抗体能中和TNF-α对L929细胞的毒性。结论：构建的真核表达载体获得了功能性表达。
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抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达
目的:通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人-鼠嵌合抗体2F7 Fab片段.方法:采用RT-PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆该抗体的重、轻链可变区基因,将2F7单抗的重、轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1-Fab中,构建得到pSW1-2F7 Fab,转化受体菌E.coil XL1-Blue,IPTG诱导表达,经Western blot和ELISA鉴定表达蛋白的活性.结果:从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因.测序证实2F7单抗的重链(VH)可变区基因全长362 bp,编码120个氨基酸;轻链(VL)可变区基因全长319 bp,编码105个氨基酸.构建的2F7人-鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达,主要分泌在菌液的上清中,表达量较高且稳定,具有与NCI-H128细胞特异性结合的活性.结论:构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段,表达产物具有与抗原结合的特异性,为进一步研究和应用打下了基础.
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分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性与稳定性的研究
目的研究在液氮中冻存2年的分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体的转染瘤细胞分泌抗体的特异性、稳定性及抗体产量.方法利用人IgG和鼠IgG作为浓度标准,绘制浓度曲线,比较研究转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量.腹腔接种转染瘤细胞诱导裸鼠产生腹水抗体,经离子交换法纯化,电泳鉴定纯化嵌合抗体.结果 1×105个/5ml转染瘤细胞培养5天的上清中,嵌合抗体分泌量为(0.5～5)μg/ml.Balb/c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后,每只裸鼠腹水量在(3～5)ml,腹水抗体经纯化,抗体产量约为(1～2)mg/(ml腹水).经离子交换法纯化,电泳鉴定,在分子量55kDa和25kDa处,可见有抗体IgG蛋白质的重链和轻链的染色条带.结论由我们制备的在液氮中冻存2年的分泌抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)的转染瘤细胞体外生长良好,抗体分泌稳定,产量高,特异性强.
关键词： CD71 人-鼠嵌合抗体 分泌抗体的转染瘤细胞 特异性 稳定性 -
人-鼠异基因移植物抗宿主动物模型的建立与检测
目的建立一种人-鼠异基因移植物抗宿主动物模型,为研究人-鼠嵌合抗体在动物体内移植排斥反应中的作用提供动物模型.方法将人外周血单个核细胞移植到裸鼠体内,记录动物的存活时间;用流式细胞术对裸鼠脾细胞表型进行分析,并经组织病理学切片鉴定移植物抗宿主动物模型(人外周血-裸鼠)的建立.结果外周血-裸鼠存活时间为(22.50±6.36) d;流式细胞术检测显示人外周血-裸鼠脾脏内人白细胞占60%;组织病理学切片显示其肝脏、肺、脾脏有大量淋巴细胞浸润.结论人-鼠异基因移植物抗宿主动物模型复制成功.
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抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究
目的对抗CD71人-鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究.方法以表达CD71分子的3种人类肿瘤细胞(K562,CEM和SMMC-7721)为靶细胞,以正常人外周血单个核细胞(PBMC)为效应细胞,在效/靶细胞比为50:1的条件下,测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(ADCC);以CEM和SMMC-7721为靶细胞,在有新鲜补体存在下,测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应(CDC).结果抗CD71人-鼠嵌合抗体(D2C)能够通过识别CD71分子,并通过人抗体Fc段介导ADCC.在有新鲜补体存在下,介导CDC.结论抗CD71人-鼠嵌合抗体对CD71+肿瘤细胞可介导ADCC和CDC.
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组织因子人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建组织因子人-鼠嵌合抗体的真核共表达载体pCN40-V_L-V_H,并转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行稳定表达,以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性.方法:从分泌鼠抗人的组织因子mAb的杂交瘤细胞株(克隆号:mTA)中抽提总RNA,经RT-PCR扩增mAb V_L和V_H的基因序列,构建重组真核表达载体pCN40-V_L-V_H,并进行酶切鉴定和测序.通过磷酸钙沉淀法转染CHO细胞,以终浓度800 μg/L G418筛选阳性细胞,通过间接ELISA、Western blot检测细胞培养上清中嵌合抗体的表达量、活性及特异性.结果:成功构建了抗人组织因子嵌合抗体真核共表达载体pCN40-V_L-V_H并在CHO细胞中表达.ELISA、Western blot证实,表达的抗组织因子嵌合抗体为人鼠嵌合抗体,该抗体能与重组人TF抗原特异性的结合且表达量为51.25 mg/L.结论:成功地构建并在真核细胞中表达了抗人组织因子嵌合抗体,为进一步的研究奠定了基础.
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抗人肿瘤坏死因子α嵌合抗体的研制
目的: 研制抗人肿瘤坏死因子(rTNF-α)嵌合抗体.方法: 以具有中和TNF-α活性的鼠源性单抗(Z12)的轻、重链可变区基因, 构建人-鼠嵌合抗体基因的表达载体, 并转染COS7细胞. 用RT-PCR、ELISA、免疫印迹及体外中和rTNF-α活性实验, 分别对瞬时表达的抗rTNF-α嵌合抗体(CZ12)的细胞培养上清进行检测.结果: ①瞬时转染后, 细胞系经RT-PCR检测有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录.②ELISA和Western blot检测表明, CZ12与TNF-α产生特异性反应, 并识别相对分子质量(Mr)为17 000的TNF-α.③竞争抑制实验中, CZ12能竞争抑制Z12与rTNF-α的特异性结合, ④体外中和实验证实, CZ12能中和TNF-α对L929细胞的毒性.结论: 成功地研制具有中和活性的人-鼠嵌合抗体CZ12.
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用于血液系统恶性肿瘤治疗的单克隆抗体
单克隆抗体(简称单抗)具有高效、低毒和靶向性强等特点,在恶性肿瘤的治疗,尤其是血液系统肿瘤的治疗中越来越受人关注.对单抗的改造方法、应用于血液系统的各种单抗的新研究进展及其优缺点进行综述,为临床用药提供指导.
