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靶向CD20和HLA-DR分子Crossmab的设计与构建表达
目的 设计、构建与表达靶向CD20和HLA-DR分子的Crossmab双特异性抗体.方法 设计靶向CD20和HLA-DR分子的Crossmab双特异性抗体分子,命名为CD20-HLA-DR CrossmabcH1-cL,利用基因工程技术构建Crossmab四条链的真核表达载体,然后利用FreeStyle 293-F Cells哺乳动物细胞表达体系表达CD20-HLA-DRCrossmabcH-CL.结果 获得了CD20-HLA-DR CrossmabcH-CL抗体分子蛋白.结论 成功设计、构建、表达并初步鉴定了靶向CD20和HLA-DR分子的双特异性抗体CD20-HLA-DR CrossmabcH1-CL,为研制新型抗肿瘤的双特异性抗体药物打下了基础.
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单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病病原体检测中的应用
感染性疾病病原体的准确检测对于其有效防控极为重要,也是合理用药、有效治疗的前提.抗体因其高度的特异性和亲和力,已经成为免疫诊断中一个关键性的分子.其类型多样,从多克隆抗体到单克隆抗体,再发展到基因工程抗体,而基因工程抗体又包括单链抗体、双特异性抗体和多特异性抗体等.各类型抗体在感染性疾病的免疫诊断方面均有应用.本文就单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病免疫学诊断方面的应用作一综述.
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抗肿瘤抗体药物的研究趋势
抗体药物是发展快的生物药物之一，为创新药物市场带来了巨大的利益，其中抗肿瘤抗体药物占主导地位[1]。自1979年第一个治疗癌症的抗体药物利妥昔单抗被美国FDA 批准上市以来，已有17个抗体药物被批准用于癌症治疗，但是其中的吉妥单抗撤出了市场[2-3]。2013年的统计显示，目前处于临床研究的抗体药物大约有350个，其中大部分都处在早期评估阶段[4]。处在 III 期临床研究的治疗性抗体包括28个单抗药物和1个单抗混合物，主要用于癌症、炎症或免疫疾病、高胆固醇、骨质疏松症、阿尔茨海默病和传染病，其中肿瘤治疗抗体10个，非肿瘤治疗抗体19个。还有许多抗体药物处在临床前研究，其研究趋势主要集中在以下几个方面，包括：抗体新靶点的发现与确认，降低抗体免疫原性的新策略，抗体与药物的偶联物，双特异性抗体以及其他新型抗体药物的研究[5-9]。
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抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体的生物学活性研究
目的研究抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体介导的特异性靶向杀伤活性.方法采用亲和层析法分离纯化本室构建的抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE、Western blot及抗活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物;采用51Cr释放试验测定其介导的体外靶向杀伤活性.结果纯化的抗Pgp/抗CD3双特异双链抗体具有与Jurkat细胞(CD3+)和K562/A02(Pgp+)细胞结合的活性;抗Pgp/抗CD3 双特异双链抗体具有介导激活的T淋巴细胞杀伤Pgp表达阳性的耐药肿瘤细胞的作用,杀伤作用的强弱显示出效靶比和剂量依赖关系,且可被CD3ScFv或PgpScFv特异性的阻断.结论抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体有望成为治疗耐药肿瘤,特别是肿瘤残留灶和微小转移灶的治疗的一种新策略.
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抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究
目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性. 方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质. 结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性. 结论抗CD3/ 抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.
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双特异性抗体介导的CD3AK体外杀伤实验研究
目的:研究在双特异性抗体的介导下CD3AK细胞(CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞)对人小细胞肺癌细胞株LTEP-sml.细胞毒作用.方法:用51Cr-Na2CrO4释放试验检测单抗(2D6、UCHT1)和双特异性抗体(WST-HT)与CD3AK共同对人小细胞肺癌细胞株的杀伤活性.结果:双特异性抗体外能明显增强CD3AK细胞对人小细胞肺癌的杀伤活性.结论:与单纯CD3AK相比加入双特异性抗体后的CD3AK细胞的细胞毒活性显著增强.
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抗CD133/CD3双特异性抗体装载的CIK细胞对高表达CD133结直肠癌细胞杀伤效应的探讨
目的：探讨抗CD133/CD3双特异性抗体装载的CIK（BsAb-CIK）细胞对高表达CD133结直肠癌细胞的杀伤效应。方法通过化学偶联制备抗CD133和抗CD3的双特异性抗体。利用CCK8试剂盒检测CIK和BsAb-CIK对高表达CD133结直肠癌细胞系（SW620和HT29）和低表达CD133结直肠癌CIK和BsAb-CIK细胞系（LOVO）的杀伤能力，并检测培养上清中细胞因子分泌水平。构建裸鼠皮下移植瘤模型，随后从腹腔进行CIK和BsAb-CIK细胞输注，1个月后取瘤称重并统计组间肿瘤生长的差异。结果在不同效靶比条件下（1∶5，1∶10，1∶20），BsAb-CIK细胞对高表达CD133的结直肠癌细胞系SW620和HT29的杀伤作用均明显强于单纯CIK组（P＜0.05），而BsAb-CIK细胞对低表达CD133的结直肠癌细胞系LOVO的杀伤作用与单纯CIK组相比，没有显著性差异（P＞0.05）。BsAb-CIK细胞INF-γ分泌明显高于单纯CIK组（P＜0.05）。与单纯CIK治疗组比较，BsAb-CIK细胞对移植瘤的生长抑制作用更加显著（P＜0.05）。结论 BsAb-CIK细胞能够有效杀伤高表达CD133的结直肠癌细胞。
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微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞
目的探讨抗P-糖蛋白(P-gp)/抗CD3微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞的作用.方法采用抗E-tag亲和层析柱分离纯化抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;采用51Cr释放实验,测定抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体介导的人T细胞体外靶向杀伤活性;采用多药耐药(MDR)细胞系KB/MDR、敏感KB细胞裸鼠移植瘤模型,测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性. 结果纯化的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体,在相对分子质量28 000和26 000处各有1条蛋白带.在抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体存在的情况下,激活的T淋巴细胞能够裂解KB/MDR细胞,且随着效靶比的增高而增高.抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体联合人T淋巴细胞能有效抑制KB/MDR细胞裸鼠移植瘤的生长,而对敏感KB细胞移植瘤的生长无抑制作用.结论抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体在体内`外均能介导人T淋巴细胞杀伤表达P-gp抗原的KB/MDR细胞,是有望用于耐药实体瘤临床治疗的双特异性抗体.
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双特异性抗体治疗恶性肿瘤
在肿瘤治疗学中,利用抗体进行肿瘤生物治疗是一个比较活跃的领域.自20世纪70年代中期Kohler和Milstein成功地建立单克隆抗体技术之后,这一疗法得到广泛的研究与探讨.用单抗治疗实体瘤的疗效不明显;治疗恶性血液病,可取得一定效果,但缓解时间相对较短.目前在肿瘤治疗方面,单抗主要用于急性淋巴细胞白血病与恶性淋巴瘤患自身骨髓移植的骨髓净化.由于单抗直接应用抗癌疗效较差,能导向药物和介导免疫细胞的双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)成为近年来抗癌治疗的热点之一.
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双特异性抗体在肿瘤治疗中的研究进展
双特异性抗体(BsAb)可以同时靶向两个不同的靶点,其功能主要是选择性招募效应细胞特异性杀伤肿瘤细胞或者结合肿瘤相关生长因子受体抑制其增殖,在肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景且发展迅速.文章主要对BsAb的类型、作用机制以及在临床上肿瘤治疗的应用现状进行综述.
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关于创新型抗体药物药学评价的思考
近年来,随着我国生物制药自主创新能力的提高,越来越多的创新型抗体药物申请注册临床试验.按照其技术特点,可分为全新序列抗体(改良型抗体或新靶点抗体)、双特异性抗体(或复方抗体)、抗体偶联物等三类.与生物类似药不同,创新型抗体的开发具有“创试性”、“阶段性”和“渐进性”等显著特点.与之相适应,其药学评价内容与技术要求也区别于生物类似药.本文总结了近年来国内外创新型抗体的发展趋势与申报现状,对代表品种的技术特点进行分析.并结合新药审评实践,着重就创新型抗体药学评价的关注点、一般考虑与评价要点展开探讨,以期促进此类药物由研发顺利转入早期临床试验阶段.
关键词： 创新型抗体 抗体工程 抗体药物偶联物 双特异性抗体 程序化细胞死亡受体1 -
双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展
双特异性抗体因其双靶向和可介导T细胞肿瘤杀伤的特点,被广泛应用于肿瘤和自身免疫性疾病的治疗.随着重组技术的进步,多种结构类型的双特异性抗体被开发出来,包括具有Fc结构域的类IgG(IgG-like)抗体以及小型化抗体.多种重组技术手段致力于解决轻重链随机错配的问题以及促进异源重链的二聚化.双特异性抗体的临床应用及商业化生产的关键点在于目标异源二聚体装配和纯化的可行性.体外装配和共培养策略具有更简单的工艺流程和更高的工艺可控性,可促进两种异源抗体的精确装配.
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双特异性抗体药物的研究进展
双特异性抗体是一类具有双功能的抗体分子,可以同时特异性结合2个不同的抗原.由于其特异性和双功能性,现已成为抗体工程领域的研究热点,在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景.目前,至少有30多种双特异性抗体药物处于临床研究阶段.本文主要对双特异性抗体药物的开发历史、分子结构和设计策略、作用机制等进行简要综述.
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急性淋巴细胞白血病新型肿瘤免疫治疗药物blinatumomab
复发性或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病,是一种预后效果不良的淋巴细胞白血病.目前,被批准用于治疗这类疾病的药物还较少.美国FDA于2014年12月3日通过加速审批批准了blinatumomab(商品名BlincytoTM,代号AMG103)用于治疗费城染色体阴性的复发性或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病.Blinatumomab是一种基于Amgen公司双特异性T细胞连接系统开发而来的肿瘤免疫治疗药物,它能选择性地靶向结合患者过度增殖的B细胞淋巴母细胞表面的CD19蛋白,同时特异性地结合T细胞表面的CD3蛋白,从而激活T细胞,通过活化的T细胞来识别和杀灭过度增殖的B细胞淋巴母细胞.本文对blinatumomab的药理作用、药动学、临床有效性以及安全性进行了综述.
关键词： blinatumomab 双特异性抗体 急性淋巴细胞白血病 CD19 -
双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点
随着生物技术的快速发展,双特异性抗体已经成为新药研发的热点.引入注目的作用是通过双靶向T细胞和肿瘤细胞,激发免疫反应将肿瘤细胞杀死.双特异性抗体的结构多样,作用复杂,与一般抗体相比,双特异性抗体的研发具有更大的挑战.双特异性抗体的非临床研究除了参考一般生物制品的指导原则外,更需要考虑如何选择相关动物种属、关注免疫相关的毒性反应如细胞因子释放综合征,同时在非临床研究向临床试验转化中更为谨慎地拟定首次临床试验起始剂量等.本文汇总分析了双特异性抗体药物非临床研究需特别关注的问题.
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双特异性抗体药物特征及其在肺癌治疗中的研究进展
随着单克隆抗体制备技术的日趋成熟以及肿瘤免疫治疗的快速发展,基于双特异性抗体的抗肿瘤药物开始进入临床.双特异性抗体药物由于其特有的可调控双特异性和功能性,已经成为恶性肿瘤免疫治疗领域的研究热点.本文对肿瘤免疫治疗中双特异性抗体药物的发展情况以及双特异性抗体药物在肺癌免疫治疗领域的研究现状进行简要综述.
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抗CD133/CD3双特异性抗体介导的细胞因子诱导杀伤细胞体外杀伤CD133阳性肿瘤细胞研究
目的 比较抗CD133/CD3双特异性抗体介导的细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)与普通CIK对胰腺癌、胃癌和卵巢癌等细胞系的杀伤作用.方法 利用杂交瘤技术制备鼠抗人CD133单克隆抗体,用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测腹水效价;经过蛋白G亲和层析法纯化得到CD133抗体,在温和的条件下与鼠抗人CD3单抗进行化学偶联,制备抗CD133和抗CD3的双特异性抗体;CCK8试剂盒检测CIK和双特异性抗体介导的CIK杀伤肿瘤细胞系.结果 收获腹水效价为1∶50000,通过标准曲线计算出CD133单抗的浓度为3.2 mg/ml;成功构建了抗CD133/CD3双功能特异性抗体介导的CIK;在相同的效靶比条件下,抗CD 133/CD3介导的CIK对表达CD133的胰腺癌细胞系SW1990、胃癌细胞系SGC7901和卵巢癌细胞系A2780有更强的杀伤作用,与单纯CIK相比有显著差异,在效靶浓度为20:1时,抗CDI33/CD3双特异性抗体介导CIK细胞较普通CIK对SW1990细胞株杀伤率提高了30.99％,对SGC7901细胞株杀伤率提高了24.42％(P＜0.05).结论 抗CD133/CD3双功能抗体可以显著改善CIK对CD133阳性肿瘤细胞的杀伤作用.
关键词： 肿瘤干细胞 细胞因子诱导杀伤细胞 双特异性抗体 CD133单抗 CD3单抗 -
双特异性抗体杵臼结构的分子动力学研究
目的 分析双特异性抗体杵臼结构(knobs-into-holes,KIH)的稳定性及异源重链二聚化的结合效率,为设计出更稳定的双特异性抗体奠定基础.方法 采用分子动力学模拟和泊松玻尔兹曼面积(molecular mechanics-Poisson Boltzmann surface area,MM-PBSA)方法分析KIH结构的稳定性并计算结合自由能,将其与标准结构CH3野生型(wild-type,WT)进行对照比较,并通过SDS-PAGE和银染技术观察二者的结合效率.结果 在355 K温度下CH3 WT均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)涨落小于1.0 (A),CH3 KIH波幅超过2.0 (A),主要是由于KIH knob部分3-27、45-52、70-80位氨基酸缺乏稳定性.WT和KIH中重链结合自由能分别为79.864 9 kJ/mol、107.008 2 kJ/mol,KIH的结合自由能更高,不利于两重链的结合.进一步计算结合面氨基酸结合能,找到了KIH中对结合作用贡献较小的10个氨基酸残基.银染观察KIH异源重链正确结合效率不足80％,远低于WT.结论 本研究发现双特异性抗体KIH结构的稳定性和重链结合效率均不如WT,并确定了KIH中缺乏稳定性和对结合作用贡献较小的氨基酸残基.
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抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达
目的构建并表达抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义.方法利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoR I 和Hind Ⅲ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定.结果经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1.5 kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明:表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为61 000;流式细胞仪结果显示:双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54.1%和53.7%.结论抗前列腺癌/抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础.
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双特异性抗体药物特征及其在肺癌治疗中的研究进展
双特异性抗体是肿瘤免疫治疗中的新药物,与常规抗肿瘤药物相比,具有特异性和双功能性的优势,生物学作用效果较好,为肿瘤靶向治疗带来了新的希望.当前,双特异性抗体已经开始应用于临床治疗,其抗肿瘤作用得到了肯定.目前,双特异性抗体在肺癌治疗中应用逐渐增多,有必要对其双特异性抗体的药物特征及其在肺癌治疗中的研究进展展开综述分析,现总结如下.
