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靶向23S rRNA的多肽核酸体外抑制细菌蛋白翻译
目的 尝试研究反义多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)在体外翻译系统中抑制细菌蛋白的翻译.方法 以增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告分子,将重组载体pET-28a-EGFP和靶向23S rRNA domainⅡ区的PNA在体外翻译系统中共同孵育后,用荧光显微镜观察荧光强度减弱,放射自显影证明荧光强度减弱是因为EGFP减少.为了分析PNA体外抑制蛋白翻译的浓度,我们用蛋白沉淀方法分析PNA体外抑制[35S]-methionine渗入蛋白比例.后,用浊度分析观察PNA(G1138)在MH肉汤培养基中的抑菌作用.结果 在体外翻译系统中,靶向23S rRNA domainⅡ区的PNA(G1138)以剂量和序列依赖方式抑制蛋白合成,抑制浓度(IC50)为0.15μmolL.在MH培养基中,PNA(G1138)抑菌效果不明显(MIC＞50μmol/L).结论 靶向23S rRNA domainⅡ区的PNA(G1138)在体外翻译系统中能有效抑制细菌蛋白合成.在MH肉汤培养基中,PNA(G1138)抑菌效果不明显.
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可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达
目的 构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体.方法 以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切EGFP基因序列和pET28a载体.T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定.将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光.体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光.免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP.结果 测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达.结论 成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体.
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体外翻译系统在分子生物学研究中的应用
体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统,是分子生物学中一种常规的表达系统.该系统可用于蛋白质快速分析鉴定,基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究,如蛋白质和蛋白质的相互作用,蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与RNA的相互作用等.
