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B族链球菌表面蛋白LrrG的分段表达及其免疫原性和功能研究
目的 研究LrrG蛋白不同片段的免疫原性及保护功能,为B族链球菌(GBS)蛋白疫苗及组分疫苗的研究奠定基础.方法 采用生物信息学的方法预测LrrG蛋白的抗原表位,结合该蛋白的一级结构特征构建3个多肽片段(Gn、Gr、Gc)并重组表达;通过免疫动物及萃取组织液检测其免疫原性;体外调理吞噬试验检测各多肽片段的保护功能.结果 成功构建和表达纯化了Gn、Gr、Gc多肽片段,且3个多肽片段均可在小鼠血清诱导产生较高水平的特异性IgG抗体,Gn免疫原性好于Gr、Gc.Gr、Gc 30 μg剂量的免疫原性均好于其10 μg和50 μg剂量.除了Gr在肺、直肠组织产生的IgA抗体有较明显升高外,Gn、Gc对黏膜及血清IgA无明显刺激作用.体外调理吞噬试验表明3个多肽片段的抗体均具有促进吞噬细胞对GBS的吞噬功能.Gr、Gc的调理吞噬活性高于Gn,与B细胞表位预测结果相符.结论 重组多肽片段均具有较强的免疫原性,在一定免疫剂量范围内,血清特异性IgG水平呈剂量依赖关系;皮下免疫对黏膜免疫影响不大;调理吞噬作用可能是LrrG蛋白具有保护作用的机制,3个多肽片段均具有潜在保护作用,支持将其作为GBS蛋白疫苗及组分疫苗的候选成分.
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B族链球菌表面蛋白C5a肽酶系统及鼻内黏膜免疫的研究
目的 研究B族链球菌表面蛋白C5a肽酶(streptococcal C5a peptidase,ScpB)系统及其鼻内途径免疫后在小鼠血清及肺、直肠、阴道等黏膜部位特异性抗体水平,探讨ScpB蛋白黏膜免疫应答的效果.方法 在大肠杆菌BL21中表达ScpB蛋白,亲和层析法进行纯化,质谱分析法对所纯化的蛋白进行鉴定.小鼠随机分为5组,每组10只.分别为对照组、皮下30μg组、鼻内5μg组、鼻内10μg组和鼻内30μg组.用ELISA法检测小鼠血清及黏膜萃取液中特异性抗体水平;调理吞噬试验检测SepB蛋白抗血清的保护性功能.结果 成功表达并纯化了ScpB蛋白;质谱分析和蛋白质库比较证实其为B族链球菌表面蛋白C5a肽酶的可能性分值为175;ELISA显示ScpB蛋白皮下30μg及鼻内不同剂量(5 μg、10 μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),30 μg剂量组IgG大于5μg及10μg剂量组(P＜0.05);鼻内不同剂量(5μg、10μg、30μg)免疫后均可诱发小鼠产生高水平的黏膜特异性IgA抗体,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);黏膜免疫组间无差异;30 μg ScpB蛋白皮下免疫后黏膜特异性IgA抗体与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).SepB抗血清对细菌具有调理吞噬作用,吞噬指数为12.3,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 B族链球菌表面蛋白C5a肽酶鼻内途径免疫小鼠后可在血清、肺及阴道、直肠等免疫近端和远端黏膜中产生相应高水平IgG及IgA抗体,上述ScpB抗体具有促进吞噬细胞吞噬B族链球菌的功能.
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B族链球菌表面免疫原性蛋白的黏膜免疫效果
目的 探讨B族链球菌(GBS)表而免疫原性蛋白(sip)的黏膜免疫效果.方法 表达及纯化两种不同标签的Sip(Gp-Sip和pET-Sip),质谱分析法鉴定纯化蛋白.用Gp-Sip免疫BALB/c小鼠,pET-Sip检测免疫小鼠血清及阴道黏膜萃取液中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的调理吞噬活性.结果 经质谱分析和蛋白质库比较证实,纯化的Gp-Sip和pET-Sip为B族链球菌Sip的可能性分值分别为177和92.ELISA检测结果显示,Sip+CT经鼻内及直肠两种途径黏膜免疫后,均可诱发小鼠产生高水平的血清IgG及阴道黏膜IgA抗体,鼻内免疫效果优于直肠;不同剂量的Sip+CT鼻内免疫后,均可在血清及阴道黏膜中检出高水平的IgG和IgA抗体,组间比较差异无统计学意义;CT和CpG-ODN1826鼻内免疫均可促进Sip产生较好的黏膜免疫效果,二者之间差异无统计学意义.Sip抗血清可明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用.结论 Sip具有较好的黏膜免疫原性,鼻内黏膜免疫效果优于直肠,CT和CpG-ODN1826两种佐剂均可有效提高Sip的免疫原性.
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抗MBL单抗1C8对人单核-巨噬细胞调理吞噬功能的影响及其机制
甘露聚糖结合凝集素(MBL)通过激活补体凝集素途径而发挥间接调理作用.本研究探讨了抗人MBL单抗1C8对凝集素途径介导人单核-巨噬细胞调理功能的影响及其机制.采用流式细胞术和荧光显微镜观察,发现1C8能抑制人单核细胞和巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬；通过凝集试验观察到,1C8能阻断重组人MBL糖识别域蛋白(rhMBL-CRD)介导的白色念珠菌、大肠杆菌凝集；ELISA和western blot分析结果显示,1C8特异性地与rhMBL-CRD结合,这种结合可被甘露聚糖、D-甘露糖胺和D-葡糖胺等阻断.结果表明,1C8通过结合糖识别域,竞争性抑制MBL与微生物表面糖结构的结合,进而阻断补体凝集素途径的活化,从而发挥对单核巨噬细胞调理吞噬的抑制作用.
关键词： 抗MBL单抗(1C8) 单核巨噬细胞 调理吞噬 糖识别域 -
血浆纤维结合白对血液除菌功能的影响
目的体外观察血浆纤维结合蛋白(PFn)对血液清除细菌功能的影响.方法用全血杀菌试验及中性粒细胞吞噬试验,研究PFn对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的调理吞噬作用与血液清除细菌功能间的关系.结果PFn对血液清除铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌有明显的促进作用,其细菌存活率与对照组相比有显著性差异(P＜0.05),且铜绿假单胞菌存活率随PFn含量的增加而降低,加入抗人Fn血清后则升高;对金黄色葡萄球菌的中性粒细胞吞噬试验显示:观察组与对照组吞噬率无显著性差异(P＞0.05),但吞噬指数由0.37提高到0.43,有显著性差异(P＜0.01).而PFn对血液清除大肠埃希菌的作用不显著(P＞0.05).结论PFn对细菌的调理吞噬作用存在菌种差异性,能促进中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬.
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铜绿假单胞菌弹性蛋白酶抑制肺表面活性蛋白A介导的免疫吞噬作用
目的 探讨肺表面活性蛋白A(SP-A)与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌肺部感染过程中的关系.方法 铜绿假单胞菌突变菌株P.aeruginosa野毒株PAO1、弹性蛋白酶LasB突变株△lasB和回复突变株PDO240LasB鼻腔接种C3H小鼠建立肺部感染模型以观察细菌的毒力变化.将同等数量的细菌与SP-A共同孵育,通过Western blot法检测SP-A的体外降解.将预先经SP-A作用过的细菌与小鼠Raw264.7巨噬细胞孵育进行体外吞噬实验以观察细菌被吞噬的情况.结果 由于弹性蛋白酶表达的缺失,铜绿假单胞菌突变菌株P.aeruginosa△lasB在通过鼻腔接种C3H小鼠建立的肺部感染模型中,与野毒株PAO1相比毒力显著降低.体外SP-A降解实验显示,△lasB基本失去了降解SP-A的能力.进一步的体外吞噬实验和聚集实验表明,△lasB在SP-A作用下更容易聚集成簇并被鼠巨噬细胞Raw264.7吞噬.结论 铜绿假单胞菌弹性蛋白酶可降解SP-A,破坏SP-A介导的细菌聚集作用.
