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问号钩端螺旋体鞭毛蛋白相关蛋白FliH/Ⅰ/Y/N基因原核表达和膜定位
目的 克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)鞭毛相关蛋白编码jliH、fliⅠfliH、和fliN并构建其原核表达系统,制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位.方法 以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基凶组DNA为模板,用PCR扩增全长fliH,fliⅠ,firY和flfliN基因片段,T-A克隆后测序,继而构建上述目的 基因克隆的原核表达系统.采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rHiN的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 表达产物.皮下免疫家兔获得4种目的 重组蛋白抗血清,用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力.采用免疫电镜技术对FliH、FliⅠ、FliY和FliN进行定位.结果 PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH,fliⅠ,fliY和fliN基因片段,与报道的序列比较.其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统均能有效地表达目的 重组蛋白,其产量均约为20%.rFliH、rFliⅠ、rFliY和rHiN蛋白免疫家兔后能产生抗体,其兔抗血清ELISA效价达到1:100 000以上,并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Westem杂交条带.FiH、FliⅠ、FliY和FliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间.结论 本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白FliH、FliⅠ、FIiY和HiN的原核表达系统,并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清.鞭毛相关蛋白HiH、Flil、FliY和FIiN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分.
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杜氏盐藻鞭毛相关蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收过程中的表达
目的:克隆杜氏盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的cDNA片段并探讨其功能.方法:分析莱茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守区域,设计简并引物.提取盐藻总RNA进行RT-PCR.根据得到的序列设计3'RACE引物,巢式PCR扩增该cDNA的3'端序列.秋水仙碱处理对数生长期的盐藻细胞,使细胞停留在分裂中期,并诱导鞭毛缩短,半定量PCR检测FAP基因的表达情况.结果:RT-PCR和3'RACE分别得到长1 535 bp和782bp的cDNA片段,拼接后总长2 141 bp,编码541个氨基酸.序列比对发现与莱茵衣藻的FAP(88％)、团藻CDC48(89％)氨基酸序列均有较高的同源性.秋水仙碱处理后盐藻细胞FAP mRNA表达量高于未处理对照组(F组间=43.192,P＜0.001；F时间=2.659,P=0.043；F交互=594.419,P＜0.001).结论:成功获得杜氏盐藻FAP的cDNA片段,该基因在秋水仙碱诱导的鞭毛重吸收过程中表达量增高.
