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跨膜型肿瘤坏死因子信号肽氨基酸部分缺失对细胞毒作用影响
目的探讨跨膜型肿瘤坏死因子(TM-TNF)信号肽在其杀瘤中的作用.方法用PCR构建突变体及体外转录、翻译蛋白质,分别获得TM-TNF信号肽胞浆段、胞外与分泌型肿瘤坏死因子(S-TNF)连接段以及部分跨膜段缺失即信号肽第-73～-47、-73～-34、-34～-1、-21～-1位氨基酸缺失的TM-TNF体外翻译蛋白.用MTT法检测其对HL-60细胞的杀伤率.结果-34～-1、-21～-1位氨基酸缺失可提高TM-TNF对HL-60细胞的杀伤,-73～-47位氨基酸缺失对其杀瘤力无明显作用,而-73～-34位氨基酸缺失可使其杀瘤率明显下降.结论去除信号肽胞外段可提高TM-TNF-α对HL-60细胞的杀伤率,而TM-TNF-α信号肽-47～-34位氨基酸在其杀瘤过程中有重要作用.
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利用噬菌体环肽库筛选可溶性肿瘤坏死因子受体1的特异性结合肽
目的应用噬菌体环肽库筛选肿瘤坏死因子α(TNF-α)的模拟肽,为研制模拟TNF-α的新型多肽药物奠定基础.方法用亲和纯化的可溶性TNF受体1 (sTNFR 1)作为筛选配基,对噬菌体随机环肽库进行亲和筛选,利用胞毒效应进行生物学筛选,并进一步对某些阳性克隆进行序列测定和分析.结果经3轮筛选,每轮的投入/产出比逐轮提高,说明筛选具有良好的富集效果.并得到模拟跨膜型TNF-α (TM-TNF-α)、可溶型TNF-α(S-TNF-α)的模拟肽和拮抗TNF作用的sTNFR 1 封闭肽.获得了TM-TNF-α的模拟肽的氨基酸序列的基序.结论获得的模拟TM-TNF-α生物学效应的sTNFR 1结合肽,可望发展成为一种新的TNF-α肽类新药.
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人类可溶性TNFR Ⅰ-GFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析
目的构建并表达hsTNFR Ⅰ(human solubletumor necrosisfactor receptor Ⅰ)-GFP(green fluorescence protein)-pET28a融合蛋白,用以检测跨膜型TNF-α(mTNF-α).方法用PCR从GFP-pKEN重组质粒中扩增GFP的cD-NA,将其插入hsTNFR Ⅰ-pET28a重组质粒中hsTNFR Ⅰ基因片段的下游,获得hsTNFR Ⅰ-GFP-pET28a重组体.转化大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导重组蛋白表达,经镍金属螯合层析柱纯化.用MTT法检测重组融合蛋白对sTNF-α细胞毒效应的抑制活性,并用重组融合蛋白直接对转染TNF基因细胞表面的mTNF-α进行定性检测.结果hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白可明显抑制sTNF-α细胞毒效应,且呈剂量依赖性;该融合蛋白不但可与NIH3T3细胞膜上鼠源性mTNF-α结合,而且也可与转基因NIH3T3细胞表面人mTNF-α结合.结论hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白具有TN-FR的生物学活性,同时保留GFP的发光特性,可用来检测细胞表达mTNF-α的水平.
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肌动蛋白参与TNFRⅡ介导的TM-TNF杀瘤活性的研究
目的 研究肌动蛋白解聚对跨膜型肿瘤坏死因子(TM-TNF)杀瘤活性的影响.方法 利用细胞松弛素D解聚肌动蛋白,采用免疫荧光技术,观察HL-60细胞内肌动蛋白的形态改变;采用细胞毒实验,检测TM-TNF杀瘤活性;采用免疫共沉淀技术和Western blot,探索肌动蛋白参与TM-TNF杀瘤活性的分子机制.结果 2μmol/L松弛素D对HL-60细胞内肌动蛋白有明显的解聚效果;肌动蛋白解聚对TM-TNF杀瘤活性有抑制作用;被刺激的HL-60细胞主要从TNFRⅡ上沉淀下大量的肌动蛋白.结论 肌动蛋白主要参与TNFRⅡ介导的TM-TNF正向信号的传递,以增强TM-TNF的杀瘤活性.
