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SIRT6的研究现状及展望
沉默信息调节蛋白(silent information regulator,SIRT)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的去乙酰化酶,哺乳动物中含有7种SIRT,定位于细胞的不同部位,并具有不同的催化活性[1].SIRT6存在于细胞核,具有NAD+依赖的去乙酰化酶和ADP-核糖转移酶活性,并参与各种细胞代谢途径,包括转录、代谢、DNA修复和基因组稳定性、增值和分化、癌症等[2].SIRT6通过其特异性催化不同的底物,参与并调节不同的细胞过程.本综述讨论了SIRT6的研究现状以及未来展望.
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过表达和敲除沉默信息调节蛋白6质粒的构建及稳定肺癌A549细胞株的筛选
目的 构建过表达和敲除沉默信息调节蛋白6(SIRT6)基因质粒,并筛选过表达和敲除稳定肺癌A549细胞株.方法 采用PCR技术扩增SIRT6基因序列,通过中间质粒pSK连接在慢病毒质粒CD513B上,鉴定正确后进行慢病毒包装,收集含慢病毒颗粒的上清感染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选出过表达SIRT6基因的稳定细胞株,蛋白质印迹法检测细胞SIRT6蛋白表达水平.利用规律成簇间隔短回重复/Cas9基因编辑技术敲除SIRT6基因,确定敲除靶点位置为SIRT6基因的第一外显子和第二外显子,分别构建第一个显子,第二外显子的SIRT6-小向导RNA(sgRNA),将SIRT6-sgRNA连接到有Cas9的质粒CD513B上后转染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选出转染成功的细胞,通过无限稀释法筛选出SIRT6敲除基因的A549细胞系,蛋白印迹法检测细胞SIRT6蛋白表达情况.结果 A549细胞的感染荧光效率接近100%,蛋白质印迹法检测过表达SIRT6基因A549细胞的SIRT6蛋白呈高表达.DNA测序检测敲除SIRT6基因A549细胞系有移码突变,蛋白质印迹法检测无SIRT6蛋白表达.结论 成功构建过表达和敲除SIRT6基因质粒,并筛选出过表达和敲除SIRT6基因的稳定肺癌A549细胞株.
