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pmiR-ERK13'UTR文献资料
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大鼠细胞外信号调节激酶1基因3'非编码区双荧光素酶报告载体的构建及rno-miR-15b-5p对其活性的影响
目的 以大鼠细胞外信号调节激酶1(ERK1)基因3'非编码区(UTR)为研究对象,构建含有ERK1基因3'UTR区的野生型以及突变型重组双荧光素酶报告载体,通过分析双荧光素酶报告载体的活性,明确rno-miR-15b-5p对报告载体的调节作用.方法 采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的总RNA,以PC12细胞的cDNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)将ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-ReportTM vector中.利用重叠延伸PCR,将ERK1基因3'UTR中的rno-miR-15b-5p潜在的靶序列TGCTGCT分别突变成CGAACGT和GTACACG,并将突变的ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-ReportTM vector中.结果 成功构建了包含ERK1基因3'UTR区的野生型报告载体pmiR-ERK13'UTR和突变型报告载体pmiR-ERK1-mut 3'UTR.利用荧光素酶活性检测系统,发现rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型报告载体的活性(P<0.001),但不影响突变型报告载体的活性.结论 成功构建ERK1基因3'UTR区野生型和突变型双荧光素酶报告载体,初步证明ERK1基因3'UTR区是rno-miR-15b-5p的结合靶点.
