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兔角膜上皮细胞培养方法的建立及60Coγ射线照射后的形态定量学研究
建立角膜上皮细胞培养的方法,并观察电离辐射照射后的形态计量改变.用角膜组织块培养原代细胞并传至3代,以10、20、30和50Gy 60Coγ射线对离体细胞样品进行照射,观察照后不同时间其形态学改变,并用图像分析仪对细胞核、细胞浆的面积及核浆比进行定量分析.发现正常的角膜上皮细胞呈多角形或棱形,胞核位于细胞正中或偏中;照射后细胞胞核、胞浆明显增大,胞质内可见空泡,界限不清,核空泡化,核膜破裂,核浓缩、碎裂等.形态计量结果证明照后细胞核与细胞浆明显增大(p＜0.01),其核浆比随照后时间的延长而减小(p＜0.01),均以20～30Gy组为明显,表明照射引起胞浆的改变(肿胀)比核更明显.本研究结果为进一步研究角膜上皮细胞的照射效应提供了基础.
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兔角膜上皮细胞短期暴露实验替代兔眼刺激实验的可行性研究
目的:探讨用兔角膜上皮细胞(SIRC)模型对眼用制剂包装材料的浸提液进行短时暴露(STE)实验,以替代动物眼刺激实验的可行性.方法:在眼用制剂包装材料的浸提液中加入不同浓度的阳性物质,同时进行STE实验和兔眼刺激实验,比较两种实验分级的一致程度.结果:两种方法对不同浓度的阳性浸提液进行实验分级的一致程度为78.6%,统计学分析证明两种方法具有相当的一致性.以动物实验的分级为标准,STE实验的灵敏度和特异性分别为100%和80%,假阳性率为20%,假阴性率为0%.结论:SIRC的 STE眼刺激实验有潜力作为眼用制剂包装材料眼刺激性实验的替代方法.
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Baicalein对兔角膜上皮细胞的毒性分析
目的 探讨12-LOX选择性抑制剂baicalein的药物毒性,为baicalein的临床应用提供参考. 方法 体外原代培养兔角膜上皮细胞,加入30μmol/L baicalein继续培养2、4、6 d,MTT法测定细胞抑制率.制作兔角膜上皮缺损模型,同浓度baicalein制成滴眼药局部应用,观察其对在体兔角膜上皮增生和移行的影响.结果30μmol/L baicalein对体外原代培养兔角膜上皮细胞作用2 d的细胞抑制率为2.6%,作m4 d、6 d对细胞生长没有明显的抑制作用.缺损闭合实验显示此浓度baicalein对在体兔角膜上皮细胞的增生和移行无任何影响. 结论 30μmoUL baicalein安全,对兔角膜上皮细胞的生长无影响.
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冰片对兔角膜上皮细胞的损伤作用
【目的】观察冰片对兔角膜上皮细胞的损伤作用。【方法】以浓度分别为100、200、400μg/mL的冰片作用于兔角膜上皮细胞，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活性， Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率； Real-time PCR法检测细胞凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达。【结果】不同浓度的冰片均可抑制兔角膜上皮细胞的活性；与正常对照组比较，冰片组可增加兔角膜上皮细胞的凋亡率，增强Caspase-3 mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）。【结论】冰片能抑制兔角膜上皮细胞的生长，诱导细胞发生凋亡，其机制与增强凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达有关。
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直流电场对培养兔角膜上皮细胞形态及活力的影响
目的:观察直流电场对体外培养兔角膜上皮细胞形态及活力的影响.方法:采用组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,将第4代角膜上皮细胞置于强度为8 V/cm的直流电场中暴露4h,停止电场作用后继续培养12h;未置于电场中的角膜上皮细胞作为对照.显微成像系统观察细胞形态改变,各时间点培养的细胞行台盼蓝染色计数,比较各组活细胞率.结果:直流电场作用后大部分角膜上皮细胞变长,并垂直于场线方向排列,停止电场暴露后,大多数细胞恢复正常形态及分布.实验组和对照组活细胞率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:短时间直流电场作用对培养的兔角膜上皮细胞的形态及活力无明显影响.
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人羊膜上皮细胞混悬液治疗兔急性角膜碱烧伤的实验研究
目的:结合体外细胞实验和在体动物实验研究羊膜上皮细胞(amnion epithelial cell,AEC)混悬液对兔角膜上皮细胞(cornea epithelial cell,CEC)生物学行为的影响及对急性角膜碱烧伤的治疗作用.方法:细胞实验:实验组将AEC及CEC于Transwell小室中培养,上室为AEC混悬液,下室接种CEC,对照组上室仅为培养基,于不同时间点行CCK-8法检测CEC的增殖活性;免疫细胞化学法检测PCNA表达;细胞划痕法观察细胞迁移能力.动物实验:采用改良的兔角膜碱烧伤模型制备方法:将10 mm直径环钻轻置于角膜中央,向环钻中央加入NaOH溶液,1 min后去环钻迅速冲洗兔眼,随机分三组(空白对照、AEC混悬液滴眼液治疗组、结膜下注射治疗组),于术后每周行裂隙灯显微镜及荧光素钠染色观察角膜情况.第28 d摘除眼球并固定行HE染色,免疫组织化学法检测角膜VEGF、mcp-1的表达.结果:CCK-8法示AEC混悬液作用后的CEC增殖活性增强(P<0.05);免疫细胞化学法显示PCNA阳性表达增强(P<0.05);划痕试验示AEC干预后CEC迁移加快.动物实验表明,滴眼液组和结膜下注射组的角膜恢复时间明显缩短,CNV面积均少于对照组(P<0.05),滴眼液组和结膜下注射组之间差异无统计学意义(P>0.05);HE染色示治疗组角膜组织炎症细胞浸润更少,组织排列更规则;免疫组化显示组织中VEGF、mcp-1表达更低(P<0.05),而滴眼液组和结膜下注射组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:AEC混悬液促进CEC增殖和迁移,影响CEC生物学行为变化.经AEC混悬液点眼及结膜下注射治疗兔眼碱烧伤后角膜修复加快,且两种方法抑制炎症反应及CNV形成,有望成为治疗急性角膜碱烧伤的新方法.
