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中医骨折三期治疗对骨生长因子BMPS表达影响的实验研究
目的:研究中医骨折三期治疗对BMPS在骨折愈合过程中表达的影响.方法:于SD大鼠双胫骨上1/3段前部的中点造成2 mm×1.5 mm的缺损.168只雄性SD大鼠随机取6只作为正常对照组,其余于术后随机平均分为模型对照组、三期治疗组和一期治疗组.三期组分早、中、晚期分别应用加减肢伤一方、二方与三方治疗,一期组应用前三方的综合方治疗,正常对照组和模型组给予相应量的生理盐水.每组于不同的时间点分别各处死6只,取材,常规组织学检查,免疫组化法检测标本中的BMPS,应用计算机图像分析系统进行定量分析.结果:中药治疗组BMPS表达平均阳性细胞数和阳性细胞的平均光密度(MOD)值显著高于模型组(P＜0.05),BMPS表达高峰期出现时间明显早于模型组,高峰期持续时间明显长于模型组.结论:中药治疗能显著促进骨折愈合过程中BMPS的表达,三期治疗明显强于一期治疗,从此说明对骨折进行分期辨证治疗是非常必要的.
关键词： 骨折/中药疗法 骨形态发生蛋白质类/分析 -
骨形态发生蛋白与骨肿瘤
骨形态发生蛋白与多种骨疾患有着直接或间接的关系,如骨发育异常、某些骨肿瘤和异位骨化等,明确他们之间的关系,有助于进一步了解此类疾病的发生、发展和预后,为选择合适的治疗方案提供指导.就骨形态发生蛋白与骨肿瘤的关系做一综述.
关键词： 骨肿瘤/代谢 骨形态发生蛋白质类/分析 综述文献 -
应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨
目的:利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨,测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达,探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异.方法:实验于2004-06/2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成.应用转染重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14 d的阳性克隆软骨细胞,以胶原-纤维蛋白凝胶为支架,构建转BMP7基因组织工程软骨.以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照,软骨细胞的接种密度为5×109 L.用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析;原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达;透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构;原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7 mRNA和蛋白的表达.结果:①BMP7基因转染软骨细胞情况:G418筛选7 d时大量细胞死亡,约30%的细胞存活.且贴壁生长.G418连续筛选14,28 d均有阳性克隆细胞生成,贴壁生长率100%,存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞.②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果:构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状,透明,体积约为16 mm×16 mm×3 mm.显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞.③组织工程软骨培养物组织学分析结果:组织工程软骨培养物体外培养7,14,28 d,细胞周围有丰富的细胞外基质,转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多,体外培养14 d软骨细胞合成和分泌为活跃.④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果:软骨细胞核周围呈棕黄色,有mRNA表达.⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况:DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加,21 d时达到高峰,转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高(P＜0.05).⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况:转BMP7基因组织工程软骨培养物体外培养14 d时糖胺多糖含量高,且各时间点糖胺多糖含量均高于未转BMP7基因组织软骨培养物(P＜0.05).⑦组织工程软骨培养物的超微结构观察:与未转BMP7基因组织工程软骨培养物比较,体外培养7 d,转BMP7基因组软骨培养物内软骨细胞细胞器发达,内质网、线粒体和高尔基体相对较丰富,细胞基质合成较旺盛;体外培养21 d,转BMP7基因组织工程软骨培养物中软骨细胞粗面内质网仍较发达,线粒体和高尔基体相对减少,细胞基质合成能力减弱.⑧BMP7 mRNA表达原位杂交测定结果:体外培养7,14,21 d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7 mRNA表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7 mRNA.⑨BMP7蛋白表达免疫组化测定结果:体外培养7,14,21 d,转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7蛋白表达,而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7蛋白.结论:成功构建转BMP7基因组织工程软骨,其生物学特性优于未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨,作为移植物修复软骨组织缺损具有一定的可行性和优越性.
关键词： 生物医学工程 骨形态发生蛋白质类/分析 转基因 软骨细胞 -
人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定
目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7.方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成.含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存.将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒.用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株.结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500 bp的条带是长度为430 bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2 500bp的条带是长度约为2 600 bp的pUC118.②重组质粒pcDNA3.1 BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000 bp的条带,全部为阳性克隆.③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1 000 bp的条带,为正向插入的阳性克隆.结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础.
关键词： 骨形态发生蛋白质类/分析 腺病毒科 基因表达 转染 -
重组pcDNA3.1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达
目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达.方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成.①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5 kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养.②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg.用含G418400 mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性.③软骨细胞转染后7 d和28 d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达.结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离.接种24 h,部分细胞开始贴壁生长,72 h后分裂增殖,7 d时细胞融合率为90%～100%.贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7 d传代1次.②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4 d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%.G418连续筛选28 d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%.未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡.③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带.少转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18 000的电泳条带.⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果:可见相对分子质量约为18 000的特异性条带.⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果:转染7,28 d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光,未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达.⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果:转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7,28 d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色,未转染的软骨细胞未见BMP7表达.结论:用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞,BMP7在关节软骨细胞中获得表达,为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础.
