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液相芯片技术及其在炎症性疾病中的应用
液相芯片技术诞生于20世纪90年代中期,由美国Luminex公司研制,是集合流式细胞、激光、数字信号处理及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术.该技术使用荧光编码的聚苯乙烯微球作为特异性反应的固相载体,通过偶联试剂的作用,将蛋白质、寡核苷酸、小分子肽类及脂肪偶联到微球的表面构成不同的检测探针.
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聚乙烯醇对聚苯乙烯微球抗蛋白吸附的作用
目的:观察聚乙烯醇在聚苯乙烯微球表面对非特异性蛋白吸附的阻抗效果,考察聚乙烯醇水解度的影响,并与聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物比较.方法:①用无皂乳液聚合法制备单分散聚苯乙烯微球:平均粒径416 nm,电泳迁移率-2.69[10-8 m2/(V·s)].②微球凝并状况测定:在聚苯乙烯微球悬浮液中加入聚合物水溶液,使微球在室温预吸附聚合物2 h,然后与溶菌酶溶液混合,于25℃恒温2 h后取样测定表观粒径,由表观粒径的变化评价因蛋白吸附诱发微球凝并的程度.③絮凝实验:将预吸附聚合物的聚苯乙烯微球悬浮液与溶菌酶混合,于37℃恒温24 h后观察絮凝状况,进而判断预吸附聚合物对蛋白吸附的阻抗性能.④蛋白吸附的定量测定:采用高速离心/液相蛋白浓度测定法分析蛋白在聚苯乙烯微球表面吸附后,液相蛋白浓度的下降值,由此推算蛋白吸附量.结果:①未经处理的聚苯乙烯微球与溶菌酶混合后发生凝并(25℃)和絮凝(37℃),而预吸附聚合物的聚苯乙烯微球与蛋白混合后,25℃时凝并程度减轻,在高温(37℃)时预吸附了低水解度(86%)聚乙烯醇或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物的微球不发生絮凝.②预吸附了低水解度聚乙烯醇的微球,蛋白吸附量下降了79%,该聚乙烯醇的抗蛋白吸附效果优于聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯及水解度为99%的聚乙烯醇.结论:①通过预吸附水溶性聚合物可抑制蛋白在聚苯乙烯微球表面吸附、聚集,水解度为86%的聚乙烯醇抗蛋白吸附效果显著优于水解度为99%的聚乙烯醇,也优于聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物.②微球的絮凝测试提供了一种快速评价预吸附聚合物抗蛋白吸附性能的方法,所获得的定性评价结果与定量测试数据一致.
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聚苯乙烯微球前房注射诱导小鼠高眼压模型
目的 建立一种新型的青光眼小鼠模型,为青光眼发病机理和治疗的研究打下基础.方法 成年C57BL/6J小鼠107只随机分为5组:A组接受15 μm聚苯乙烯微球前房注射(n=28)；B组接受10μm微球注射(n=44)；C组分别于0d及23 d接受2次10 μm微球注射(n=15)；D组为对照组,接受PBS前房注射(n=10)；E组为空白对照(n=10)；所有鼠右眼注射.注射后每2d用TonoLab眼压计测量眼压1次以监测眼压变化.在眼压持续升高14 d、28 d或56 d时,采用电镜、荧光金逆行标染以及免疫组织化学的方法对视网膜神经节细胞和轴突变性的情况进行定量评估并比较；同时在眼压升高14 d、28 d时,用双重标染的方法对比荧光金及β-Ⅲ-tubulin免疫标染视网膜神经节细胞的结果有无差异.结果监测双眼眼压,D组小鼠在实验期间眼压值稳定,为(10.3±1.6)mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),与E组(10.0±1.5)mmHg相比差异无统计学意义；87只接受微球前房注射的小鼠眼有81只较对照眼升高.A组注射15 μm微球后可以诱导眼压上升约14 d,峰值为(21.8 ±2.1)mmHg.单次注射10μm直径微球可以诱导眼压上升28 d,峰值达到(24.4±6.2) mmHg；在23 d时进行第2次注射,高眼压状态可以维持到56 d.B组14 d、28 d及C组首次注射后56 d,与对侧眼视神经截面相比,轴突丢失率分别为(22.4±2.1)％、(28.0±3.1)％和(42.0±3.8)％；而同样时间点下视网膜神经节细胞的丢失率分别为(23.8±2.3)％、(35.8±4.4)％及(45.3±3.9)％,各组间差异均有统计学意义.双重标染β-Ⅲ-tubulin和荧光金发现,β-Ⅲ-tubulin阳性细胞的数量分别为(3150±30)个·mm-2(14 d)和(2574±165)个·mm-2(28 d),而荧光金阳性细胞数量分别(3040±465)个·mm-2(14 d)和(2433±192)个·mm-2(28 d),各组间差异均无统计学意义.结论前房注射微球能够高效且稳定地诱导小鼠眼压升高和青光眼视神经病变,是一种较理想的新型青光眼模型.
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分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定
目的 探讨分枝菌酸(MA)包被聚苯乙烯微球诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞化的条件及特性.方法 将RAW264.7细胞分为空白对照组和分别包被(0、25、50、75、100) μg/mL MA的聚苯乙烯微球实验组,分别将细胞与聚苯乙烯微球混匀、共同孵育24、48、72 h、5d和8d后,油红O染色后显微镜下观察细胞形态,采用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定各组泡沫细胞内胆固醇酯的含量,采用MTT法检测细胞增殖水平.结果 当包被MA浓度为75 μg/mL、吞噬时间为24 h时,RAW264.7能形成典型的泡沫细胞,其细胞内胆固醇酯相对含量为60.98％±1.32％;随着吞噬时间延长,形成泡沫细胞所需的MA的浓度逐渐递减;且随着细胞泡沫化程度增加,细胞增殖活力逐渐减弱.结论 MA包被聚苯乙烯微球可快速诱导巨噬细胞形成泡沫细胞,MA浓度与细胞泡沫化程度呈正相关,且有时间依赖性.
