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先天性室间隔缺损患者GATA4基因新突变的识别
目的 识别先天性室间隔缺损患者新的GATA4基因突变,以确定其在室间隔缺损中的防治价值.方法 收集160例先天性室间隔缺损患者的临床资料和血标本,以200名健康者为对照.应用PCR扩增GATA4基因的全部外显子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序.借助BLAS工程序将所测序列与GenBank中的已知序列进行比对,以识别基因突变,并用Clustal W 软件分析突变氨基酸的保守性.结果 从160例先天性室间隔缺损患者中,发现3例室间隔缺损患者的GATA4基因中各有1个新的杂合错义突变,即第191、267和380位的密码子分别由AGC、GTG和GTG变为GGC、ATG和ATG,导致第191、267和380位的氨基酸分别由丝氨酸、缬氨酸和缬氨酸变为甘氨酸、蛋氨酸和蛋氨酸,亦即S191G、V267M和V380M突变;200名健康对照者均无这些突变.多物种GATA4基因编码氨基酸序列比对显示,第267位的缬氨酸在进化上高度保守.此外,还发现了1个不改变氨基酸的单核苷酸多态,即c.99 G>T多态,但这些多态在室间隔缺损组(GG基因型87.5%,GT基因型12.5%,TT基因型0%)和健康对照组(GG基因型93.0%,GT基因型7.0%,TT基因型0%)间的频率分布差异无统计学意义(两组基因型频率比较,χ~2=3.1441,P=0.0762;等位基因频率比较,χ~2=2.987 7,P=0.083 9).结论 从先天性室间隔缺损患者的GATA4基因中识别出新的杂合错义突变,揭示了室间隔缺损的新分子病因,这将有助于室间隔缺损的早期防治.
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柯萨奇B3病毒对心脏发育因子GATA-4、NKx2.5表达的影响及叶酸对其保护作用
目的：探讨叶酸对孕期感染柯萨奇B3病毒(CVB3)的新生鼠心脏发育因子GATA-4、NKx2.5的基因与蛋白表达的影响。方法 SD雌鼠分为对照组、叶酸组、CVB3组、CVB3+叶酸组。叶酸组及CVB3+叶酸组孕前给予叶酸灌胃2周；CVB3组及CVB3+叶酸组孕第7天腹腔注射CVB3，连续5 d，自然分娩后取新生鼠心脏组织，病理切片HE染色观察新生鼠心脏组织形态学变化；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot测定新生鼠心脏组织中转录因子GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达水平。结果 CVB3组新生鼠心肌损伤明显，心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂，CVB3+叶酸组状态改善。CVB3组新生鼠心脏组织GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达低于对照组（P＜0.05）， CVB3+叶酸组GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达高于CVB3组（P＜0.05）。结论孕鼠早期感染CVB3抑制新生鼠心脏发育因子正常表达，补充叶酸对新生鼠心脏发育具有明显保护作用。
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过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞修复心肌损伤的效果研究
目的 探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复心肌损伤的机制.方法 于2015年3月—2016年12月,选取60只健康4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠,分离BMSCs,采用流式细胞检测CD29、CD44、CD11b、干细胞抗原1(SCA-1)表达率.通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs,构建过表达GATA-4-BMSCs,并加入基因开启剂多西环素(DOX),采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染72 h后过表达GATA-4-BMSCs中GATA-4 mRNA表达水平,并以未转染为阴性对照组.建立小鼠心肌梗死模型,经尾静脉注射BMSCs(n=3)、空载体-BMSCs(n=3)、过表达GATA-4-BMSCs(n=3)500μl,并将心肌梗死未处理组(n=3)及正常小鼠(n=3)同时给予喂食含有DOX的液体作为对照1组及对照2组.通过心脏彩超检测给予干预措施72 h后心功能改善情况.选取正常小鼠正常喂养(n=3)作为对照3组.采用小动物活体成像检测心脏区域荧光强度,番茄凝集素评估心肌梗死局部心肌血管数量,免疫组化检测心肌梗死局部C-kit阳性细胞数量.结果 小鼠BMSCs CD29表达率为98.0％,CD44表达率为100.0％,CD11b表达率为0.1％,SCA-1表达率为99.5％.过表达GATA-4-BMSCs组GATA-4 mRNA表达水平为(78.17±1.32),高于阴性对照组的(0.57±0.34)(t=2.576,P<0.05).各组小鼠射血分数(EF)、环比收缩(FS)变化值比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中过表达GATA-4-BMSCs组EF、FS改善幅度高于对照1组、对照2组、BMSCs组和空载体-BMSCs组(P<0.05).各组小鼠心脏区域荧光强度、心肌血管数量、C-kit阳性细胞数量比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中过表达GATA-4-BMSCs组心脏区域荧光强度、C-kit阳性细胞数量多于对照1组、对照2组、对照3组、BMSCs组和空载体-BMSCs组(P<0.05),心肌血管数量多于BMSCs组和空载体-BMSCs组.结论 过表达GATA-4-BMSCs可以通过增强"归巢"效应、促进心肌梗死局部血管增生、有效动员C-kit阳性细胞修复心肌损伤.
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转录因子GATA4和甲胎蛋白在小鼠胎肝和肝癌细胞中的表达对比及相关性
目的:探讨转录因子GATA4和甲胎蛋白(AFP)在小鼠胎肝和肝癌细胞中的表达及二者相关性.方法:获取小鼠孕10.5 d、孕13.5 d、孕15.5 d、孕17.5 d、出生后0.5 d的肝组织,半定量RT-PCR检测GATA4和AFP mRNA的表达,并以成鼠肝、正常肝细胞株和肝癌细胞株作为对照.将小鼠GATA4真核表达载体成功转染正常肝细胞并鉴定,将多柔比星作用肝癌细胞,然后均进行以下指标监测:半定量RT-PCR法检测GATA4、AFP和胎蛋白转录因子(FTF)mRNA的表达,免疫印迹法检测GATA4和AFP蛋白的表达,ELISA法检测细胞上清AFP的含量.结果:随着胎肝细胞分化的不断成熟,GATA4和AFP的表达逐渐下降,至出生后0.5 d已降至成肝水平.GATA4、FTF和AFP在正常肝细胞不表达,而在肝癌细胞高表达;正常肝细胞转染GATA4后,FTF和AFP表达显著增高,其细胞上清液AFP含量亦明显增高.多柔比星作用肝癌细胞后,6 h内GATA4的表达首先降低;随着时间延长(≥12 h),FTF和AFP表达逐渐降低,细胞上清液AFP含量亦逐渐降低,差别具有显著的统计学意义.结论:GATA4在胎肝组织和肝癌细胞中高表达并可能对AFP也有一定的上调作用.
