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J-HNP-1多肽的重组及体外抗菌作用研究
目的:将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行重组使其成为一种新的杀菌肽分子J-HNP-1,并将其构建于能有效表达和分泌活性J-HNP-1杀菌肽的哺乳动物细胞表达系统.方法:应用PCR技术从不同的质粒中获得J链基因和HNP-1基因,然后应用重组PCR技术将这两个不同的基因连接在一起而成为J-HNP-1基因.将此基因克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中.用脂质体转染法将此重组子导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平采用RT-PCR和Western blot分析J-HNP-1的表达情况,并体外检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性.结果:获得的J链基因和HNP-1基因大小分别为489和297 bp.采用RT-PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约786 bp的片段,其大小与预测相符;采用Western blot印迹法,用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约Mr 24 000处有强反应条带显示;抗菌活性检测显示,经rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1转染的COS-7细胞的可溶性蛋白和培养上清均有明显的抗菌活性,抑菌圈的直径分别为34和43 mm.结论:重组J-HNP-1基因构建到哺乳动物细胞表达系统,并体外表达,具有抑菌作用.
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C端带Myc和多聚组氨酸双重标签基因的改构体J-HNP-1在COS-7细胞的转染表达
目的改构α-防御素-1(HNP-1)使其成为一端带J链的改构体J-HNP-1分子,并探索建立能有效表达和分泌J-HNP-1,其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳动物细胞表达系统.方法利用重组PCR技术,使HNP-1一端带上J链;将J-HNP-1 DNA片段插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1;将此重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析J-HNP-1的表达情况,并同步检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性.结果采用RT-PCR法从被转染的细胞中扩增出1条约786bp的片段,其大小与预测相符;采用Western印迹法,用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在相对分子质量约24×103处有强反应条带显示;细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性检测显示,经rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1转染的COS-7细胞的可溶性蛋白和培养上清均有明显的抗菌活性.结论α-防御素-1(HNP-1)被成功改构成杀菌肽J-HNP-1;所建立的J-HNP-1哺乳动物细胞表达载体系统能有效表达和分泌活性J-HNP-1.
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带J链的α-防御素-1基因转染COS-7细胞后的表达检测
目的将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因重组为一种新的杀菌肽分子JHNP-1,观察J-HNP-1在细胞内的表达及分泌情况.方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别从pCH-J质粒和pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出J链和HNP-1;进行重组PCR,获取 J-HNP-1 DNA 片段,并插入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中;用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入COS-7细胞,然后应用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Histag 标签基因.结果用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约24 ku处均有强反应条带显示,其大小与预测相符;对照组未见相应条带显示.结论采用Western blot检测到新的杀菌肽分子J-HNP1在细胞内得到表达并分泌到细胞外,为进一步研究J-HNP1杀菌肽的抗菌活性奠定了基础.
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带J链的α-防御素-1的基因重组和表达载体的构建
目的将α-防御素-1(HNP-1)改建为一种杀菌分子J链α-防御素-1(J-HNP-1),这种杀菌分子具有与细胞膜上具备的多聚IgA受体(PIgR)相结合而进入粘膜上皮细胞的能力,发挥其杀菌作用.即克隆人J chain-HNP-1嵌合基因DNA,并构建真核表达载体.方法将从pCH质粒中获取的J链片段,采用人工连接方法与HNP-1片断相连接,并将其构建于新型哺乳动物细胞质粒表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,进行序列测定.结果经过重组得到的J链防御素-1的目的片断为786bp,序列分析与GenBank中报道的编码J链及HNP-1成熟肽的序列完全一致.结论J chain-HNP-1嵌合基因DNA的克隆和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础.
