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甘氨鹅脱氧胆酸钠致阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中bcl-2 mRNA的表达意义
目的:探讨bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的调控作用.方法:健康♂Wistar大鼠,进腹,游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予以结扎.进腹后不结扎切断胆总管作为阴性对照.结扎后3,7,14,21 d处死大鼠,每组8只.采用胶原酶原位肝灌注法获取体外培养正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠肝细胞.分别收取正常大鼠及胆总管结扎大鼠肝细胞1×109/L-1,用Trizol试剂盒一步法提取大鼠肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增;用PCR扩增bcl-2和对照β-actin基因片段;分离的正常大鼠及胆总管结扎14 d大鼠的肝细胞行原代培养,培养板内置小飞片,使用100μamd.L-1甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24h后,用FCM法分析肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测.结果:体外培养正常大鼠及结扎3 d大鼠肝细胞bel-2 mRNA的表达为阴性,仅见β-actin条带;胆总管结扎大鼠体外培养肝细胞在结扎后7 d即可见肝细胞内bel-2 mRNA的表达,其吸光度A值为O.13±0.15;结扎后14、2l d也可检测其表达,bcl-2 mRNA吸光度在结扎14 d达高峰,为O.56±0.21,且与结扎7、2l d相比,两者差异有显著性(P＜0.05);100tanol@L-1的G,CDC作用正常大鼠肝细胞后,凋亡明显增加,凋亡率为34.9±2.9%;胆总管结扎14d大鼠的肝细胞凋亡比率为15.6±2.1%,100μanol@L-1的GCDC作用胆总管结扎14 d大鼠肝细胞后,凋亡率无明显增加,为17.3±1.1%,两者差异无显著性(P＞0.05);GCDC作用的两组大鼠肝细胞凋亡率差异有显著性(P＜0.05).结论:阻塞性黄疸大鼠肝细胞有bcl-2基因的表达,正常大鼠肝细胞则无表达;在阻塞性黄疸过程中,大鼠肝细胞通过表达bcl-2来抑制胆盐致肝细胞的凋亡作用.
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GCDC诱发体外培养大鼠肝细胞凋亡的实验研究
在阻塞性黄疸中因胆汁瘀积引起胆盐的升高,进而导致肝损害,但其损害机制尚未阐明.阻塞性黄疸(阻黄)时胆盐对肝细胞凋亡的影响知之甚少.我们用DNA含量流式细胞术.(FCM)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)研究不同浓度的甘氨鹅脱氧胆酸钠.(GCDC)对体外培养大鼠肝细胞凋亡状态的影响,以探讨阻黄肝损害的病理机制.1材料和方法1.1材料①肝细胞的分离与培养:采用胶原酶原位肝灌注法.健康♂Wistar大鼠,氯胺酮0.2 mg/kg ip,麻醉后固定体位,消毒皮肤后进腹,显露游离门静脉后距肝门2 cm处插入18号导管,用D-Hanks液(含0.1 g/L EDTA,pH 7.4,37℃)以25 mL/min灌入,然后于肝下后腔静脉插入16号导管放出积血积液;门静脉改用0.5 g/L IV型胶原酶及0.1 g/L DNase IHanks液持续灌注5min,取下肝脏,置入含4℃Hanks液的平皿中,剪去肝被膜,加2.5 g/L胰蛋白酶继续消化20min,Hanks液终止,100目尼龙网过滤,加RPMI 1640 50mL,制成混合肝细胞悬液,置入37℃恒温水浴中孵化10min,过滤,离心,去上清,4℃hanks液重悬用40 g/L盼蓝染色判断肝细胞活率,用细胞计数板记数细胞浓度.细胞培养于合成培养基(含RPMI 164080 mL,新生小牛血清20 mL、青霉素100 kU/L,链霉素100 g/L,胰岛素0.1 kU/L,以及hepes 15mmol)培养条件37℃,50 mL/L CO2②主要试剂:IV型胶原酶、DNaseI、胰蛋白酶、甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)、碘化丙锭(PI)染色剂为Sigma公司产品;细胞凋亡原位检测试剂盒(TUNEL)为德国宝灵曼公司提供.
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胆汁酸对胃癌细胞株MKN-28生长的影响
背景:胆汁反流是常见现象,其对胃上皮细胞生长的影响尚不明确.目的:探讨胆汁酸体外对胃癌细胞株MKN-28生长的影响.方法:采用MTT法测定不同浓度牛磺石胆酸钠(TLC)和甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)对胃癌细胞株MKN-28生长的影响.结果:第1～6 d,60～300 μmol/L TLC可明显抑制MKN-28细胞生长,且呈剂量依赖性.300 μmol/L GCDC干预24 h可显著抑制MKN-28细胞生长.结论:脂溶性胆汁酸TLC和水溶性胆汁酸GCDC体外均可直接抑制胃癌细胞生长.
