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基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析ERK的磷酸化
目的 运用基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析(Nanofluidic proteomic immunoassay,NIA)方法检测ERK的磷酸化.方法 构建尾加压素Ⅱ (Urotensin Ⅱ)受体GPR14细胞系,UⅡ(10-7M)刺激该细胞系10分钟后,提取细胞蛋白采用传统Western方法和NIA技术分别检测同种样品ERK的磷酸化,并用两种方法观察UⅡ受体拮抗剂Urantide对ERK磷酸化的抑制作用.通过结扎C57BL/6小鼠冠状动脉左前降支,建立心梗模型,假手术组开胸不结扎,术后1周通过流式细胞术分离心脏侧群干细胞(Cardiac side population cells,CSPs),用N1A技术检测ERK磷酸化.结果 Western分析可观察到UⅡ介导ERK1/2的磷酸化,Urantide抑制该效应.NIA分析可观察到UⅡ介导ERK1/2磷酸化的多种异构体包括p-ERK1a,p-ERK1b,pp-ERK1,pp-ERK2水平升高,Urantide同样抑制该效应.心梗后CSPs数目明显增加.NIA分析显示,心梗促进CSPs上的p-ERK1b,pp-ERK1的水平升高,但对pp-ERK2影响不大.结论 通过GPR14细胞系的分析,NIA技术灵敏度高,可检测ERK磷酸化的多种形式,运用该技术可检测数万个CSPs的ERK磷酸化,可观察心梗促进CSPs的某些ERK磷酸化异构体的水平升高,提示可能与心梗后CSPs的增殖有关.
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ERK磷酸化在预测结直肠癌患者预后的价值
目的:通过探索研究ERK磷酸化在预测结直肠癌患者预后的分子标志物中的临床价值.方法:选择佳木斯大学附属第一医院2015-09~2017-01我院普外科收治的临床诊断为结直肠癌的患者.分别采用免疫组化积分法判定癌组织和癌旁正常黏膜组织ERK蛋白磷酸化情况,术后间断随访出院患者的生存质量状态.以术后3个月、6个月、12个月为随访分界点.结果:①正常结直肠粘膜组织几乎无ERK磷酸化;②高ERK磷酸化状态的结直肠患者生存时间短于低ERK 磷酸化患者.结论:P-ERK1/2在结直肠癌组织中表达明显高于癌旁组,表明P-ERK1/2可能与结直肠癌发生、发展有一定相关性.
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内皮素-1和血管紧张素Ⅱ对肾上腺皮质癌细胞ERK1/2磷酸化的交互作用
目的:内皮素1(ET-1)和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)均能刺激肾上腺皮质细胞增殖,促进球状带细胞分泌醛固酮,但是,两者联合作用对皮质细胞产生的影响目前研究较少,涉及的信号传导通路尚不清楚.本实验拟研究ET -1和AngⅡ联合处理对肾上腺皮质癌H295R细胞的ERK磷酸化的影响.方法:不同剂量ET -1和AngⅡ刺激H295R细胞,用Western blot检测ERK1/2磷酸化水平；用AngⅡ1型受体拮抗剂坎地沙坦及ETA拮抗剂BQ610预处理细胞,再加入ET-1及AngⅡ单独或共同刺激细胞,Western blot检测磷酸化ERK1/2.结果:ET -1和AngⅡ均呈剂量依赖性刺激细胞ERK1/2磷酸化,两者的佳刺激剂量均为100 nM；ETA受体拮抗剂BQ610能完全阻断ET -1的作用,而AngⅡ 1型受体拮抗剂坎地沙坦完全阻断AngⅡ的作用.ET -1和AngⅡ共处理细胞与两者单独刺激细胞在ERK1/2激活上无明显改变.结论:ET -1和AngⅡ均激活H295R细胞ERK,且两者无交互作用.
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myc-p62融合蛋白的表达及其对ERK磷酸化的抑制
目的 构建带myc标签的自噬标志蛋白P62基因真核表达载体,获得myc-p62融合表达蛋白,并对其功能进行初步检测.方法 利用聚合酶链式反应从乳腺文库中体外扩增人P62基因编码序列,将其与空pXJ-40-myc载体正确连接,重组质粒myc-p62转染HEK293T细胞,用Western blot法检测该融合蛋白的表达情况,并检测该蛋白对细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响.结果 构建得到myc-P62基因的真核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源性基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;经Western blot法检测,融合蛋白成功表达,并能够抑制ERK磷酸化.结论 成功表达了myc-p62融合蛋白并能抑制ERK磷酸化.
