首页 > 文献资料
-
腺病毒介导的靶向P85和Akt1短发夹RNA对人胃腺癌细胞生长抑制作用的研究
目的 构建靶向P85和蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对人胃腺癌细胞SGC-7901生长的抑制效果.方法 构建腺病毒载体rAd5-P+A,体外转染SGC-7901细胞后,以实时定量PCR和Western blot分别检测P85和Akt1的mRNA和蛋白质的表达.以噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性.构建裸鼠皮下荷瘤模型进一步观察rAd5-P+A对SGC-7901细胞生长的抑制效果,并应用原位末端标记技术(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 成功构建的rAd5-P+A重组腺病毒载体转染SGC-7901细胞后可显著抑制p85和Akt1的mRNA表达,而P85和Aktl蛋白表达量在转染48 h、72 h后分别下调57.5%、63.7%和67.8%、75.6%,与空白对照组和通用腺病毒对照(rAd5-HK)组相比,差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.003).与空白对照组和rAd5-HK组相比,SGC-7901细胞的增殖活性在rAd5-P+A转染后第2天明显下降(P<0.001),且rAd5-P+A转染组进入S期的细胞数减少了5.9%～7.1%,而进入G0/G1期的细胞增加了12.1%～13.7%.裸鼠皮下荷瘤模型治疗实验也显示,rAd5-P+A可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡.结论 腺病毒介导的靶向P85和Akt1的shRNA可抑制人胃腺癌细胞的生长,这可能为胃腺癌靶向性联合基因治疗提供新的策略.
-
蛋白激酶B1去类泛素化修饰抑制肝癌的增殖和转移
目的 探讨沉默泛素载体蛋白9(Ubc9)基因表达诱导蛋白激酶B1(AKT1)去类泛素化修饰,及其对肝癌细胞增殖和转移的影响.方法 利用RNA干扰技术沉默HepG2肝癌细胞Ubc9基因表达,Western blot法检测Ubc9、小泛素相关修饰蛋白1(SUMO1)和蛋白激酶B1(AKT1)蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测HepG2细胞增殖活性,细胞划痕实验和Transwell方法检测细胞迁移能力.建立荷瘤鼠模型,测量肿瘤体积并绘制生长曲线,解剖肿瘤组织并称重比较.采用原位细胞凋亡实验检测肿瘤组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肿瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和 MMP-9的表达情况.结果 siR-Ubc9基因转染可使HepG2细胞中Ubc9、共轭SUMO1、游离SUMO1和AKT1蛋白水平均明显下降(均P<0.05).对照组、siR-neg组和siR-Ubc9组的细胞增殖指数分别为53.19%、54.25%和39.17%,细胞迁移距离分别为(59.47±4.66)μm、(56.56±5.37)μm和(34.57±6.61)μm,发生迁移的细胞数量分别为(89.44±8.36)个/视野、(93.84±8.79)个/视野和(41.67±5.39)个/视野,siR-Ubc9组与对照组和siR-neg组差异均有统计学意义(均P<0.05).对照组、siR-neg组和siR-Ubc9组的皮下肿瘤重量分别为(3.78±0.69)g、(3.72± 0.72)g和(2.09±0.61)g,细胞凋亡率分别为(7.79±2.21)%、(6.45±2.48)%,和(33.59±5.44)%,siR-Ubc9组与对照组和siR-neg组差异均有统计学意义(均P<0.05).对照组和siR-neg组肿瘤组织中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白均高表达,而siR-Ubc9组肿瘤组织中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达均低表达,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论 通过沉默肝癌细胞中Ubc9基因表达能够诱导AKT1去SUMO化修饰,进而抑制肝癌细胞的增殖和转移,为未来肝癌基因治疗提供了新的借鉴方法.
关键词： 肝肿瘤 小泛素相关修饰蛋白1 蛋白激酶B1 细胞增殖 肿瘤转移 -
补阳还五汤对大鼠脑缺血后蛋白激酶B1和c-Jun氨基末端激酶1/2表达的影响
目的探讨补阳还五汤对脑缺血后大鼠蛋白激酶B1（AKT1）和c-Jun氨基末端激酶1/2（JNK1/2）的影响。方法将48只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、补阳还五汤组，每组12只。采用大脑中动脉闭塞法（MCAO）建立右侧局灶性脑缺血大鼠模型。补阳还五汤组大鼠于术后2h起灌服补阳还五汤（主要由生黄芪120g、当归6g、赤芍4.5g、川芎3g、西红花3g、桃仁3g、广地龙3g组成）14.2 g/kg，每日1次，连续7 d。其他各组动物均给予等体积生理盐水。于第7日处死大鼠，取脑组织，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定AKT1 mRNA表达，采用免疫组化法检测JNK1/2蛋白表达。结果与正常对照组和假手术组比较，模型组AKT1 mRNA表达量〔吸光度（A）值〕明显降低（0.48±0.08比0.63±0.11、0.61±0.09，均P＜0.05），JNK1/2阳性细胞数（个/mm2）明显增多（34.13±4.57比16.15±1.09、16.23±2.05，均P＜0.05）；与模型组比较，补阳还五汤组脑组织中AKT1 mRNA表达（0.93±0.11）和JNK1/2阳性细胞数（45.04±5.68）明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论补阳还五汤可上调缺血脑组织AKT1 mRNA和JNK1/2阳性细胞数表达，是其脑保护作用机制之一。
关键词： 补阳还五汤 脑缺血 蛋白激酶B1 c-Jun氨基末端激酶1/2 -
八聚体结合转录因子4与蛋白激酶B1基因在卵巢浆液性肿瘤组织表达及耐药相关性研究
目的 研究八聚体结合转录因子4(OCT4)和蛋白激酶B1 (AKT1)基因在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达,探讨两者之间相关性及在化疗耐药中发挥的作用.方法 全部病例来自中国医科大学附属盛京医院2004年1月至2010年10月.采用免疫组织化学SP法对67例卵巢浆液性腺癌(化疗耐药30例,化疗敏感37例)、10例卵巢交界性浆液性囊腺瘤、10例卵巢良性浆液性囊腺瘤和10例正常卵巢组织中OCT4和AKT1的表达情况进行检测.结果 OCT4的阳性表达率在卵巢浆液性腺癌、卵巢交界性浆液性囊腺瘤、卵巢良性浆液性囊腺瘤和正常卵巢组织中依次降低,差异具有统计学意义(P=0.002);在耐药组和敏感组的阳性表达率分别为83.33％和45.95％,差异有统计学意义(P=0.002).AKT1蛋白在正常组、良性组、交界性组和恶性组的阳性表达率分别为0、40.00％、70.00％、62.69％,差异具有统计学意义(P=0.001);在耐药组和敏感组的阳性表达率分别为76.67％和51.35％,两组比较,差异有统计学意义(P=0.033).OCT4蛋白与卵巢浆液性癌临床病理因素无关,AKT1蛋白与卵巢浆液性癌的临床分期呈正相关(P＜0.05).OCT4与AKT1蛋白在耐药组中呈正相关(r=0.388,P=0.034);在敏感组无明显相关性(r=0.246,P=0.142).结论 OCT4和AKT1可能与卵巢浆液性癌发生、发展相关,并可作为耐药性的预测指标;AKT1蛋白表达为卵巢浆液性癌的临床分期提供依据.
-
PI3KCA及Akt1在人胆管腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系
目的 探讨PI3KCA与Akt1表达与胆管癌病理特征的关系及其对胆管癌预后的预测价值.方法 采用免疫组化检测PI3KCA、Akt1在人胆管腺癌及癌旁正常胆管组织中的表达;采用Western blotting法及(qRT)-PCR法检测新鲜人胆管腺癌及癌旁正常胆管组织中PI3KCA、Akt1在蛋白及mRNA水平表达.结果 PI3KCA和Akt1表达于胆管腺癌细胞质,在癌旁正常胆管组织中PI3KCA、Akt1无表达或轻度表达,差异有统计学意义(x2=2.659,P＜0.05; x2=1.353,P＜0.05);PI3KCA高表达与肿瘤直径、肿瘤TNM分期、淋巴结转移有正相关性(x2=3.526,P＜ 0.05;x2=5.295,P＜0.05; x2=8.174,P＜ 0.05);Akt1高表达与肿瘤直径、肿瘤TNM分期、淋巴结转移有正相关性(x2=7.102,P＜0.05;x2=3.142,P＜ 0.05;x2=5.491,P＜0.05);Spearman rank相关分析结果显示,PI3KCA、Akt1呈统计学正相关性(r=0.376,P＜0.05);Western blotting显示,PI3KCA、Akt1蛋白表达在胆管癌组织中明显高于配对的癌旁正常组织(t=2.142,P＜0.05;t=3.549,P＜ 0.05);PI3KCA、Akt1在胆管腺癌组织中mRNA表达明显高于配对的癌旁正常组织(t=3.276,P＜ 0.05;t=4.901,P＜ 0.05).结论 PI3KCA及Akt1在人胆管腺癌中高表达,其表达上调提示胆管癌预后不良,PI3KCA可能通过PI3K/Akt信号通路调节胆管癌的恶性行为.
关键词： 胆管腺癌 磷脂酰肌醇3激酶α亚单位 蛋白激酶B1 -
靶向性蛋白激酶B1和环氧合酶-2 shRNA腺病毒载体的构建和在人胃癌细胞的表达
目的 构建靶向性蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)和环氧合酶-2(COX-2)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,观察其在人胃癌细胞株SGC-7901中的表达.方法 利用同源重组技术构建重组腺病毒载体pGSadeno-Akt1+COX-2(pGSadeno-A+C),经酶切及测序鉴定后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组rAd5-A+C腺病毒,并测定病毒的滴度.体外转染人胃癌细胞株SGC-7901后,Real-time PCR和蛋白印迹分别检测Akt1和COX-2 mRNA和蛋白质的表达.结果 成功构建rAd5-A+C重组腺病毒,测定包装的病毒滴度为1.0×1010pfu/ml.转染组Akt1和COX-2 mRNA表达明显下调,其△Ct值分别是(12.26±0.05)和(5.41±0.09),比rAd5-HK空载组(10.63±0.02)、(3.75±0.08)和对照组(10.57±0.02)、(3.73±0.08)增高(P<0.01),而空载组和对照组比较ΔCt值无明显变化(P>0.05).同样转染组Akt1和COX-2蛋白表达量与空载组和对照组比较分别下调70.5%和63.7%(P<0.01),空载组和对照组比较Akt1和COX-2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 靶向性Akt1和COX-2的shRNA腺病毒载体可以特异性抑制Akt1和COX-2的表达,可能成为胃癌靶向性Akt1和COX-2基因治疗的新策略.
-
下调Akt1表达对胆管癌HUCCA-1细胞增殖、凋亡的影响
目的:观察Akt1干扰后胆管癌HUCCA-1细胞增殖、细胞周期及凋亡变化,及其与下游蛋白的相关性.方法:构建干扰质粒siAkt1转染胆管癌HUCCA-1细胞,Western印迹法及qRT-PCR法检测转染效率及Akt1下调后凋亡相关基因表达.MTT法检测细胞增殖,PI法检测细胞周期,流式细胞术检测细胞凋亡.结果:MTT显示,与MOCK组和siRNA control组对比,siAkt1转染后HUCCA-1细胞增殖能力减弱,在72h及96h差异均具有显著性(P＜0.05);转染siAkt1细胞停留在G1期比例增高,G2及S期比例减少(P＜0.05);转染后早期凋亡及晚期凋亡率均升高(P ＜0.05;P ＜0.01).在siAkt1转染后,凋亡相关基因p85mRNA及p-Akt1(磷酸化的Akt1)mRNA表达水平降低(P＜0.05),Cleaved Caspase-9 mRNA及Cleaved Caspase-8mRNA表达升高(P＜0.05).凋亡相关基因p85及p-Akt1蛋白表达降低(P＜0.05),Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-8蛋白表达水平升高(p＜0.05).结论:对胆管癌HUCCA-1细胞中Akt1表达进行下调导致细胞增殖能力下降,促进细胞进入G1期,凋亡率升高,机制与其下游Cleaved Caspase基因表达具有相关性.
