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两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较
目的:比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响.方法:取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞(NPCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs).取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养.共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养.实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs.共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs.然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-TimePCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量.将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P＜0.05为有统计学差异.结果:从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs.待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记.按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs.经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加(P＜0.05);C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加(P＜0.05).结论:在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势.
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人原代肺动脉内皮-平滑肌接触式共培养方法的技术改进
目的:改进人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)-人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)接触式共培养方法,为更好模拟体内两种细胞间相互作用提供研究平台.方法:采用微孔聚碳酸酯膜为载体,将HPAECs和HPASMCs接种于微孔膜两侧,建立HPAECs-HPASMCs联合培养模型以模拟正常血管壁两种细胞的结构关系,通过调整细胞种植密度、培养时间、培养液体系、培养基种类、血清浓度等,倒置相差显微镜、Hoechst染色及流式细胞术比较不同条件下接触式共培养模型中细胞贴壁、生长和凋亡的差异,免疫荧光染色观察优化共培养条件后细胞标记物的表达变化.结果:①明胶预包被Transwell膜可促进内皮细胞的黏附和生长;②渗透压升高增加内皮细胞凋亡;③内皮细胞培养基较DMEM、RPMI 1640更有利于接触式共培养模型的建立;④内皮细胞生长因子为1％、胎牛血清为2％时两种细胞生长稳定;⑤优化共培养条件对两种细胞的自身特性无显著影响.结论:当培养体系为内皮细胞培养基、维持1％内皮细胞生长因子及2％胎牛血清组分条件,可建立稳定的HPAECs-HPASMCs接触式共培养模型,为体外模拟人肺动脉血管壁结构功能和研究两种细胞间相互作用构建了良好平台.
关键词： 肺动脉内皮细胞 肺动脉平滑肌细胞 接触式共培养 Transwell小室
