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脐带华通胶间充质干细胞移植对退变椎间盘影响的实验研究
目的:探讨人华通胶间充质干细胞(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)移植对犬退变椎间盘的影响.方法:从新生儿脐带中提取WJMSCs,取增殖良好的第3代细胞,用含有绿色荧光蛋白的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染标记细胞.选择20只健康成年比格犬作为实验动物,使用穿刺抽吸髓核组织法建立椎间盘退变模型(L4/5、L5/6、L6/7).4周后将犬各节段椎间盘进行分组:L3/4为对照组(A组);L4/5为退变组(B组);L5/6为注射组(C组),注射生理盐水;L6/7为移植组(D组),移植绿色荧光蛋白标记的WJMSCs细胞悬液.造模术前、术后4、8、12、24周行腰椎X线及MRI检查.24周后处死动物取材进行冰冻切片荧光、HE染色及番红O染色等组织学检测,提取髓核组织总RNA,反转录后行Real Time PCR检测,观察蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9及Ⅰ型胶原基因表达变化.结果:分离培养的WJMSCs贴壁生长,呈梭形形态,rAAV2-EGFP病毒感染后第3天表达绿色荧光.影像学检查结果显示各组椎间盘高度指数及相对灰度指数在造模术前、术后第4周无统计学差异,术后8、12、24周,D组椎间盘相对高度指数及相对灰度指数较B、C组高(P＜0.05),比A组低(P＜0.05).术后24周,D组髓核组织冰冻切片内能够检测到GFP阳性的WJMSC细胞,HE染色显示D组髓核组织退变比B组和C组轻,番红O染色结果显示D组染色较B组和C组深,基因表达检测结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9基因表达比B、C组高(P＜0.05),但比A组低(P＜0.05).结论:人WJMSCs移植入犬退变椎间盘内能够存活,促进椎间盘细胞外基质Ⅱ型胶原及蛋白多糖合成,维持椎间盘高度及髓核含水量,能够有效延缓椎间盘退变进展.
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接触式细胞共培养诱导人脐带华通胶间充质干细胞向类髓核细胞分化
目的:观察接触式细胞共培养条件下,人髓核细胞对脐带华通胶间充质干细胞(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的诱导分化效应,为椎间盘退变性疾病的治疗寻找种子细胞来源.方法:取足月产健康新生儿脐带约30cm,分离、纯化、培养WJMSCs;取人椎间盘髓核组织,酶消化法分离培养髓核细胞.取第三代稳定增殖的WJMSCs,利用流式细胞方法检测细胞免疫表型CD73/CD90/CD 105/CD34/CD45/HLA-ABC/HLA-DR.用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记WJMSCs,与髓核细胞以1:1比例进行混合,在6孔板中进行接触式细胞共培养;以单独培养的WJMSCs为对照组.培养7d后利用高速流式细胞仪分选荧光标记阳性的WJMSCs,提取细胞总RNA,进行反转录获得cDNA,利用Real-Time PCR方法检测其Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅵ型胶原、蛋白多糖、SOX-9和多能聚糖基因的相对表达,管家基因GAPDH作为内参,单独培养的WJMSCs作为对照,利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达变化.结果:WJMSCs原代细胞接种24h可见部分细胞贴壁生长,形态为梭形和多角形,1周后形成集落,2周时细胞融合达到90％.流式细胞检测结果显示CD73/CD90/CD1 05/和HLA-ABC(+),CD34/CD45和HLA-DR(-).与髓核细胞共培养7d后WJMSCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达较对照组显著性增加(P＜0.01),Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原和多能聚糖基因相对表达未见显著性变化(P＞0.05).结论:通过接触式细胞共培养人脐带WJMSCs能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,可为组织工程技术和细胞治疗修复退变椎间盘提供种子细胞来源.
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电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的佳条件
背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体.然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染佳条件占据重要地位.目的:探讨不同电穿孔条件对脐带华通胶间充质干细胞转染率的影响,以确定佳电转染条件.方法:通过控制电压、脉冲时长及细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测转染率.结果与结论:①电压自125 V至150 V,转染率呈现递增趋势,150 V时获得大转染率,但将电压进一步调高至170 V,转染率开始显著降低;②脉冲时长为5.0 ms时获得大转染率;脉冲时长为2.5 ms和7.5 ms时转染效率均有所降低;③与低氧培养比较,正常培养的细胞转染率更高;④结果表明,正常培养的脐带华通胶间充质干细胞在电压150 V、脉冲时长5.0 ms、脉冲间隔时间50 ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率.
