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抗PEA受体结合区单克隆抗体的制备及鉴定
目的:探讨绿脓杆菌外毒素A(PEA)中和性单克隆抗体在预防和治疗绿脓杆菌感染中的免疫保护作用.方法:以重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得4株能稳定分泌抗PEA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,2E12和3C6.结果:细胞培养上清ELISA效价为4000～8000,腹水ELISA效价可达25600～51200,其中3C6抗体在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,其亲和常数为8.93×108.结论:获得的单克隆抗体可在抗烧伤绿脓杆菌感染中发挥重要作用.
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新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的构建表达与活性鉴定
目的:构建新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的原核表达载体,诱导表达后检测其生物活性.方法:PCR扩增绿脓杆菌外毒素A PE40KDEL基因插入到pET32a(+),然后与合成的含有肠激酶酶切位点和肝癌特异性结合肽A54的核酸序列连接,构建重组表达载体pET32a(+)-A54-PE40KDEL,其经鉴定后转化E.coli BL21 表达.超声破菌,上清液经Ni+亲和层析纯化,肠激酶酶切,再次Ni+离子亲和层析后得到免疫毒素A54-PE40KDEL.MTT和间接免疫荧光技术检测其对不同细胞株的细胞毒性及靶向性.结果:重组质粒序列正确,经Western blot证实表达产物含Mr约58 000的目的蛋白.A54-PE40KDEL能够与肝癌细胞特异性结合,且对肝癌细胞的毒性作用与对照相比有极显著性差异(P＜0.01).结论:成功构建了A54-PE40KDEL原核表达载体;获得的新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL在体外与肝癌细胞具有一定结合特异性及杀伤活性,为肝癌导向治疗提供了一条可行的途径.
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MSH-PE40重组毒素的构建和抗头颈部肿瘤的实验性研究
目的构建以绿脓杜菌外毒素A(PE40)为毒性部分的重组毒素,并研究其抗头颈部肿瘤的效应.方法利用基因工程技术将α促黑激素(α-melanoma stimulating hormone,α-MSH)与绿脓杆菌外毒素A的部分重组基因,克隆到高效表达载体pET-20b中,表达出重组蛋白MSH-PE40,进行头颈部肿瘤细胞的体外杀伤实验.结果成功地将α-MSH基因与PE40基因融合,处于T7启动子和终止子调控之下.初步纯化的MSH-PE40对黑色素瘤具有明显的细胞毒性.结论 MSH-PE40具有特异性杀伤α-MSH受体的肿瘤的功能.
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绿脓杆菌外毒素A受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65融合蛋白的表达及纯化
目的 在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化.方法 从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEA Ⅰ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEA Ⅰ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化.结果 重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30％以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10000.纯化的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白纯度达90％以上.结论 已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEA Ⅰ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础.
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IL-2与绿脓杆菌外毒素A嵌合蛋白的研究
目的获得IL-2绿脓杆菌外毒素A嵌合蛋白,用于相关疾病的治疗.方法用PCR方法扩增分离IL-2和PEA的基因,将IL-2基因的3′端与绿脓杆菌外毒素A基因的5′端连接后克隆至pBV220上,转化大肠杆菌DH5a.挑取菌落培养,快速提取质粒进行酶切,并在温控条件下表达.结果经鉴定,获得重组质粒pBV/IL-2/PEA.温控诱导表达后SDS-PAGE分析表明,在51 000处有蛋白表达带.以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的嵌合蛋白.结论本研究建立了一种制备IL-2/PEA嵌合蛋白的方法,该方法也可用于表达其他蛋白.
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绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38质控方法和质量标准的建立
目的 建立人性腺激素释放激素类似物-绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38的质控方法和质量标准.方法 采用HeLa细胞/结晶紫比色法测定GP38蛋白的生物学活性,并进行精密性和回收率验证;反相高效液相色潜法(RP-HPLC)测定其纯度,用自编CPM软件进行肽图比较分析;其他检测项目按<中国药典>三部(2005版)规定进行.结果 GP38蛋白生物学活性测定方法经验证,原液试验内变异系数(CV)为10%,试验间CV值为20%;成品试验内CV值为12%,试验间CV值为21%.用该法对GP38蛋白原液和成品进行检测,其生物学活性分别为(3 736±483)和(1 777±260)U/ml.原液经RP-HPLC分析,纯度为(97.1±0.2)%,符合其质量标准大于95.0%的规定.用自编CPM软件分析肽图结果显示,相同酶切条件重复检测的相似度大于0.99,不相同次酶切、相同条件重复检测的相似度大于0.90.其他各项检测结果均符合<中国药典>三部(2005版)的相关要求.结论 所建立的质控方法和质量标准可用于GP38蛋白产品的常规检定.
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绿脓杆菌外毒素A单链抗体基因的制备及其克隆的研究
为制备中和活性较高的单抗细胞2F6的单链抗体(ScFv)基因,以绿脓杆菌外毒素A(PEA)类毒素为免疫原,用单克隆抗体技术制备可分泌具有中和活力单克隆抗体的杂交瘤细胞,再应用RT-PCR从其中一株杂交瘤细胞中扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(G4S)3将VH和VL基因连接成ScFv基因,并将其克隆至pGEM-T载体中.经核酸序列分析证实,VH、VL和Linker基因连接正确,基因全长729bp.经计算机分析VH、VL基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因的特征.VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ(A)和轻链κⅥ家簇.
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促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A与胃癌细胞受体结合竞争的研究
目的探讨重组人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A(LHRH-PE40)在胃癌细胞及正常细胞是否存在相应受体表达及存在竞争性抑制.方法将胃癌细胞系BGC-823及正常人肾细胞系293制备成细胞膜,利用125I标记的LHRH-PE40与两种细胞膜进行放射性配基分析,以及与LHRH竞争结合分析.结果人肾细胞系293未见配基-受体特异性结合;而人胃癌细胞系BGC-823的结合竞争符合特异性配基-受体结合、竞争.BGC-823细胞亲和力:Kd=(37.82±1.42)nmol/L,容量Bmax=475.00±17.86 pmol/mg.结论LHRH是胃癌免疫治疗的有效靶点,LHRH-PE40对过度表达LHRH受体的胃癌均具有特异有效的抗肿瘤活性.
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绿脓杆菌外毒素A常用肽编码基因的克隆与鉴定
目的 对绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)的常用肽编码基因进行克隆,为后续的基因改良奠定物质基础.方法 以绿脓杆菌基因组DNA为模板,以PEA编码基因特异区段为引物,克隆绿脓杆菌外毒素A常用肽编码基因,经菌落PCR筛选出阳性克隆后再进行DNA测序分析.结果 PCR产物克隆后,菌落PCR挑选得到了3个有意义的阳性克隆,DNA测序结果与GenBank中登录的序列之间一致性达99%.结论 成功获得3个阳性克隆;选择适当的退火温度,采用Touchdown PCR,能保证顺利扩增出目的 基因及保证扩增的特异性.
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重组免疫毒素TRAIL DR5/ScFv-PE25的构建及活性检测
目的:构建绿脓杆菌外毒素PE融合抗TRAIL DR5单链抗体基因TRAIL DR5/ScFv的原核表达载体,诱导表达,并检测其生物学功能.方法:根据TRAIL DR5单链抗体HGS-ETR2的氨基酸序列,优化密码子,合成全长的编码序列作为模板,PCR技术扩增TRAIL DR5/ScFv基因,基因重组技术将两段TRAIL DR5/ScFv与PE25基因连接,组成TRAIL DR5/ScFv-PE25融合基因.重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),高子交换层析和亲和层析技术纯化重组蛋白.WST-8技术检测细胞毒性.结果:成功构建了重组免疫毒素基因TRAIL DR5/ScFv-PE25,重组蛋白经纯化后,每升发酵液可得到4.95mg融合蛋白(纯度95％),该融合蛋白具有抑制A431/H9和Panc 3.014癌细胞增殖的作用.结论:成功表达并纯化TRAIL DR5/ScFv-PE25重组免疫毒素,检测其生物学活性,为TRAIL DR5阳性癌细胞的靶向治疗研究奠定了基础.
