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绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪干细胞治疗后肢缺血的实验研究
目的：观察绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠来源的脂肪干细胞（ADSCs）治疗小鼠后肢缺血的效果及其自身所带荧光标记的有效性。方法取4周龄GFP转基因小鼠的脂肪组织，消化获取GFP来源的脂肪干细胞（GFP-ADSCs），并用流式鉴定其表面的干细胞抗原。建立C57BL/6小鼠左后肢缺血模型并随机分成两组（每组16只）：一组后肢缺血的肌肉组织内注射P3代的GFP-ADSCs 1×106个/100μl，对照组于同样部位注射100μl PBS。1个月后利用苏木素-伊红（HE）、免疫组织化学（IHC）及免疫荧光（IF）染色行CD31染色观察缺血肌肉组织内血管新生情况。结果①从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获得大量GFP-ADSCs并表达干细胞表面抗原CD90及CD105；②GFP-ADSCs被成功地诱导成脂成骨；③GFP-ADSCs组总残肢恢复率显著高于PBS组（P<0.05）；④1个月后 GFP-ADSCs治疗组缺血的肌肉组织内IHC 染色CD31可见较多的新生血管，其微血管密度数显著高于PBS组（P<0.05）；IF 染色显示GFP-ADSCs治疗组的新生血管表达内皮细胞的特异性标记CD31和GFP，而PBS组则未见GFP绿色荧光表达。结论从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获取大量的ADSCs，其能够促进小鼠后肢缺血肌肉组织内的血管新生，自带的GFP可以示踪ADSCs在受体内的存活、迁移及分化。
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GFP转基因裸鼠脾脏组织学观察
目的 探讨GFP基因导入对BALB/c荧光裸鼠脾脏组织学及免疫功能的影响.方法 取不同日龄(14日龄、28日龄、49日龄、70日龄)BALB/c荧光裸鼠及BALB/c普通裸鼠各32只,雌雄各半,处死取脾脏,对脾脏的绝对重量、脾脏指数进行测量分析,对脾脏的组织学改变进行观察,并对脾脏淋巴细胞数进行统计分析.结果 与14日龄荧光裸鼠相比,28日龄荧光裸鼠脾脏指数明显较高(P <0.05).与14日龄荧光裸鼠相比,49日龄、70日龄荧光裸鼠淋巴细胞数明显变少(P <0.05).与普通裸鼠(14日龄、28日龄、49日龄、70日龄)相比较,相同日龄荧光裸鼠(14日龄、28日龄、49日龄、70日龄)淋巴细胞数明显减少(P <0.05).结论 GFP基因对不同日龄荧光裸鼠的脾脏发育及其功能有一定影响.
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基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较
将外源基因导入真核细胞的方法很多.我们通过对绿色荧光蛋白(GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究,比较了较常用的两种方法-脂质体转染法和磷酸钙转染法.研究结果表明:脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高,且简单易行,是外源基因导入体外培养细胞内较理想的方法.
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以GFP为报告基因的酿酒酵母mRNA在哺乳动物细胞中的表达
目的研究酵母mRNA在哺乳动物细胞中的翻译表达.方法半乳糖诱导GFP基因在酿酒酵母细胞中表达,提取其mRNA,RT-PCR鉴定,并以脂质体为介导,对血管内皮细胞HUVFC以及绿猴肾细胞COS-7进行体外转染.结果被转染HUVEC和COS-7细胞分别出现绿色荧光,报告基因GFPmRNA在动物细胞中被识别、翻译.结论提示酵母mRNA可能作为基因治疗物质应用于口服基因治疗的研究.
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以GFP为报告基因的重组酿酒酵母消化道转基因研究
目的以GFP为报告基因,研究重组酿酒酵母消化道途径转基因的可能.方法以6～8周龄Balb/c小鼠为实验对象,根据管饲材料不同对动物进行分组:第1组为空白对照组;第2组管饲酿酒酵母INVScl;第3组管饲携带酿酒酵母-哺乳动物细胞穿梭载体pYES-CMV-GFP的重组酿酒酵母;每次每只Balb/c小鼠灌胃0.3lml(108个)重组酿酒酵母悬浮液,2 d 1次,持续4周后采用免疫组织化学染色法检测小鼠小肠、肝脏、脾脏组织中GFP基因的表达.结果在第3组小鼠小肠、肝和脾组织中,有免疫组化呈阳性的检测结果,其中6只小鼠中的4只小肠组织免疫组化结果呈阳性,肝脏、脾脏分别有1只免疫组化结果呈阳性,而阴性对照组中小鼠的各组织结果均呈阴性.结论以酿酒酵母作为基因载体实现消化道途径转基因存在可能,为进一步研究酿酒酵母在基因治疗药物载体上的应用提供了实验基础.
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慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究
目的 构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法 实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果 电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论 成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.
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放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统慢病毒载体的构建及125I诱导表达的研究
合成了含8个CArG元件的放射敏感性启动子E8,将其连接于胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase,CD)基因及GFP报告基因上游,构建了重组慢病毒载体pGC-FU- E8 codA- GFP.与慢病毒包装系统共转染293T细胞包装重组慢病毒颗粒E8 -coda- GFP LV,研究重组慢病毒感染EJ细胞在不同剂量125I的电离辐射下绿色荧光表达情况及其将5 -FC转化为5- FU的能力.结果显示:构建的含有E8启动子及CD基因的重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒滴度为2×108 TU/mL；经125I照射的重组慢病毒感染EJ细胞均可观察到绿色荧光,其细胞上清液均可检测到5- FC转化成的5- FU紫外峰,其中55.5 kBq及74.0 kBq 125I照射的细胞组绿色荧光明显,148 kBq125I照射的细胞组,其5 -FU紫外峰为明显.以上结果表明:本工作所构建的放射敏感性启动子调控CD 基因/5 -FC自杀系统重组慢病毒载体具有电离辐射调控作用,可在125I的电离辐射作用下诱导下游基因表达,为放射性核素125I联合CD基因/5 -FC自杀系统对肿瘤细胞的治疗作用研究提供了实验基础.
