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胶质细胞源性神经营养因子对体外培养大鼠精原干细胞PLZF和c-Kit表达的影响
目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠原代培养的精原干细胞(SSC)早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)、原癌基因c-Kit基因转录及表达的影响.方法 采用含不同浓度GDNF(0、10、50、100 ng/m1)的DMEM培养液原代培养大鼠SSC.RT-PCR检测SsC中PLZF mRNA、c-Kit mRNA水平,蛋白质印迹法检测PLZF、c-Kit蛋白表达情况.结果 对照组和GDNF 10 ng/nl组细胞随着培养时间延长,生长速度无明显变化,而GDNF 50和100 ng/ml组细胞生长速度明显加快.对照组PLZF和c-Kit mRNA表达量分别为0.28±0.13、0.65±0.21,GDNF 10 ng/ml组分别为0.27±0.14,0.62±0.19,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);GDNF 50 ng/ml组分别为0.64±0.28、0.34±0.15.与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);GDNF 100 ng/ml组分别为0.68±0.27、0.28±0.18,与50 ng/ml组比较差异无统计学意义(P＞0.05).对照组PLZF和c-Kit蛋白表达量分别为0.34+0.13、0.72±0.27 GDNF 10 ng/ml组分别为0.38±0.18、0.69±0.26,与对照组比较差异元统计学意义(P＞0.05);GDNF 50 ng/ml组分别为0.68±0.26、0.35±0.15,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);GDNF 100 ng/ml组分别为0.70±0.27、0.32±0.11,与50 ng/ml组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 随着GDNF浓度增加,SSC增殖水平升高,而分化受抑制.GDNF对SSC增殖和分化有一定的调控作用.
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大鼠pEGFP-PLZF真核载体的构建及在精原细胞中的表达
目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-PLZF,并了解其在大鼠精原细胞中的融合蛋白表达情况.方法:参考分子克隆技术,采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用脂质体转染的方法导入精原细胞中,观察有无荧光的表达及用Western blot检测蛋白表达情况.结果:实验从大鼠睾丸组织中获取了编码plzf基因的全序列cDNA,产生了2 kb的目的插入片段,与pEGFP-N1载体连接后经酶切电泳鉴定及DNA测序证实序列正确;重组质粒转染精原细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,并用Western 1blot:检测到106 kD目的蛋白的表达.结论:新构建的重组质粒pEGFP-N1-PLZF通过鉴定,结构正确.转染到精原细胞后能在其中表达,发挥功能,为后续研究奠定了基础,对研究PLZF调控精原细胞增殖和分化机制具有重要的意义.
关键词： 早幼粒细胞白血病锌指蛋白 重组质粒 绿色荧光蛋白 精原细胞
