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肠黏膜屏障损伤与结肠癌患者恶病质的关系
目的 探讨细菌易位(bacterial translocation,BT)与结肠癌患者恶病质的关系.方法 选取2015年9月至2017年5月间青岛市市立医院和南京大学医学院附属金陵医院收治的292例接受右半结肠切除术结肠癌患者的临床资料,分为恶病质组和非恶病质组.采用细菌培养方法检测外周血和肠系膜淋巴结细菌,利用PCR技术检测外周血中细菌DNA,用流式细胞计数法检测肠黏膜T细胞亚群数和NK细胞数,用Western blot和免疫荧光法检测紧密连接蛋白Occludin、Claudins-2、Zonula occluden-2在肠上皮细胞中的表达,用荧光原位杂交检测易位细菌;用免疫组织化学方法检测小肠壁内毒素.结果 恶病质组BT率高于非恶病质组(27.8％比7.2％,x2=20.871,P＜0.001).BT(+)患者肠黏膜中BT与肠上皮细胞中T细胞亚群和NK细胞水平降低有关(CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+ T/CD8+T、NK细胞水平分别为:36.69％±5.87％比41.63％±5.03％、44.08％±5.12％比49.58％±7.01％、65.68％ ±5.51％比61.43％±5.58％、0.71％±0.21％比0.91％±0.23％、27.86％±3.93％比34.69％ ±4.52％,均P＜0.01).恶病质组BT(+)患者小肠壁内可以检测到内毒素.在BT(+)患者中Claudin-2蛋白升高(0.63 ±0.13比0.21 ±0.06,t=-2.936,P＜0.01),而Occludin和Zonula occluden-2蛋白降低(0.37±0.13比0.84±0.17,t=2.151,P＜0.05;0.16 ±0.07比0.58 ±0.19,t=2.111,P＜0.05).结论 BT可能促进结肠癌患者恶病质的发生,BT可能经肠上皮紧密连接发生.
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CLDN9基因与垂体瘤样细胞瘤侵袭相关性的实验研究
目的 研究CLDN9在无功能性垂体腺瘤亚型瘤样细胞瘤中的表达及其与瘤样细胞瘤的发生和侵袭性的相关性.方法 收集20例来源于首都医科大学附属北京天坛医院神经外科的瘤样细胞瘤标本(侵袭性和非侵袭性瘤样细胞瘤各10例)和3例正常垂体组织标本.通过实时定量PCR和Western blot检测CLDN9在正常垂体组织与瘤样细胞瘤之间,以及侵袭性与非侵袭性瘤样细胞瘤之间的表达差异.通过免疫组织化学方法检测Ki-67在瘤样细胞瘤标本中的表达.采用Logistic回归分析检验Ki-67与瘤样细胞瘤侵袭性的相关性.结果 实时定量PCR结果显示,在瘤样细胞瘤中CLDN9基因的表达明显高于正常垂体组织(P＜0.01),且在侵袭性瘤样细胞瘤中的表达(6.54±0.32)高于非侵袭性瘤样细胞瘤(2.47±0.12)(P＜0.01);Western blot检测结果显示,CLDN9蛋白在侵袭性瘤样细胞瘤中的表达明显高于非侵袭性瘤样细胞瘤(3.331 ±0.165比2.497±0.125,P＜0.01).Ki-67＞ 3％的瘤样细胞瘤标本中,侵袭性4例,非侵袭性3例,统计结果显示Ki-67与瘤样细胞瘤的侵袭性无相关性(P=0.946).结论 CLDN9可能是与瘤样细胞瘤的侵袭性特异相关的一个重要基因.
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角膜上皮屏障功能的研究现状
角膜上皮位于眼球壁的外层,是外界物质进入眼内的主要通道.在生理状态下,角膜上皮表层细胞之间相互作用,形成一道具有选择性通透功能的屏障.完整的角膜上皮屏障功能不仅能保证正常代谢所需的营养物质进入眼内,而且能防止外界异物或致病微生物侵袭.近,大量的临床及实验研究表明,角膜上皮屏障功能异常是许多眼表疾病发生、发展的病理学基础.此外,研究发现参与构成角膜屏障功能的多种蛋白质还参与细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生理和病理过程.本文回顾总结了近年来关于角膜上皮屏障结构、功能及其影响因素等研究的现状.
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脑水肿分子机制的研究进展
脑水肿是指脑内水分增加导致脑容积增大的一种病理现象，是脑组织对各种致病因素的反应。颅内损伤、缺血、缺氧、炎症、脑代谢障碍、肿瘤以及中毒都会引起脑水肿。脑水肿可导致颅内压的升高，当颅内压升高到一定程度时，脑组织就会发生功能和结构的损害，严重者导致脑死亡。先前对脑水肿发病机制的研究包括血脑屏障学说、钙离子学说、脑微循环障碍学说、脑细胞代谢障碍等。但是近年的研究表明脑水肿的发生与水通道蛋白4、基质金属蛋白酶、紧密连接蛋白、炎性细胞因子等密切相关。本文就脑水肿发生的分子机制进行综述。
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乌司他丁通过上调Claudin-1的表达抑制大鼠肿瘤周围水肿
目的 探讨乌司他丁对大鼠肿瘤周围水肿的影响及其分子机制.方法 采用大鼠原位胶质瘤模型,将大鼠随机分为2组:对照组和乌司他丁治疗组.于治疗1周后通过核磁共振成像检测肿瘤体积和水肿体积,蛋白印迹法检测细胞紧密连接蛋白Claudin-1的表达变化.结果 乌司他丁治疗组肿瘤体积明显减小,水肿体积明显减小,细胞紧密连接蛋白Claudin-1的表达明显上升.结论 乌司他丁通过上调Claudin-1的表达抑制肿瘤的生长和肿瘤周围水肿的发生,为其在临床的应用提供理论基础.
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自然衰老与D-半乳糖诱导的衰老大鼠肠道形态学和上皮紧密连接蛋白表达的对比研究
目的 研究自然衰老大鼠和D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠肠道组织形态学、小肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白表达的变化,评估两种衰老模型大鼠肠道屏障结构和功能.方法 将大鼠分为26月龄组(A组)、D-半乳糖组(B组)和3月龄组(C组)3组.取各组大鼠回肠组织常规HE染色观察形态学改变,透射电镜下观察肠上皮细胞间紧密连接超微结构,采用Real-time PCR检测小肠黏膜组织中紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的mRNA表达,采用Western blot检测ZO-1和Occludin的蛋白表达.结果 A组和B组大鼠小肠黏膜厚度及绒毛高度均比C组大鼠降低[/小、肠黏膜厚度:A组(89.88±6.12) μm、B组(87.62±6.32) μm、C组(162.91 ±7.28) μm,P＜0.05;绒毛高度:A组(59.95±4.47)μm、B组(56.43±5.38) μm、C组(108.12±6.42) μm,P＜0.05].透射电镜下观察到A组和B组大鼠的肠上皮细胞间紧密连接比C组疏松,间隙增宽,密度降低.与C组比较,A组和B组大鼠的小肠组织中ZO-1、Occludin mRNA和蛋白的表达均减少(均P＜0.05).而A组与B组大鼠的小肠黏膜厚度、绒毛高度、小肠组织中ZO-1、Occludin mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义.结论 自然衰老大鼠和D-半乳糖诱导的衰老模型大鼠小肠黏膜结构和上皮屏障功能均受损,小肠黏膜厚度、绒毛高度等肠道组织形态学指标,上皮细胞间紧密连接结构的改变和紧密连接蛋白表达下调等变化具有高度一致性.
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实验性结肠炎大鼠结肠上皮claudin-1、-2、-4表达改变
背景:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎症病变,大量研究表明,UC肠黏膜损伤与紧密连接蛋白改变有关.目的:探讨实验性结肠炎大鼠结肠中claudin-1、-2、-4的表达.方法:将40只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组和模型组,给予大鼠7.5 mg/mL恶唑酮灌肠制备实验性结肠炎模型,以等量0.9%NaCl溶液灌肠作为正常对照.造模7 d后,行大体评分和结肠组织学评分,以ELISA法检测血清和结肠中细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10含量,免疫组化和蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白claudin-1、-2、-4蛋白表达,实时PCR法检测claudin-1、-2、-4 mRNA表达.结果:与正常对照组相比,模型组结肠大体评分和组织学评分均显著升高(P<0.05);血清和结肠组织IL-4和IL-5含量均显著增高(P<0.05),而两组TNF-α 和IL-10含量无明显差异(P>0.05);claudin-1、-4 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),claudin-2 mRNA和蛋白表达显著增高(P<0.05).结论:实验性结肠炎大鼠中紧密连接蛋白claudin-1、-2、-4的分布和表达发生改变,导致肠黏膜屏障功能受损,有望作为UC治疗的潜在靶点.
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溃疡性结肠炎患者结肠黏膜干扰素-γ、occludin和闭锁小带蛋白-1表达及其相关性研究
背景:溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性结直肠炎症病变,在我国的发病率呈持续上升趋势,但其病因尚未完全阐明.目的:探讨UC患者结肠黏膜干扰素-γ(IFN-γ)、occludin、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的表达情况以及其间的相关性.方法:纳入2011年1月-2011年7月在天津医科大学总医院就诊的UC患者40例,选取20名同时期健康体检者作为正常对照组.采用免疫组化染色检测结肠黏膜IFN-γ、occludin、ZO-1蛋白的表达和分布,采用实时荧光定量PCR检测结肠黏膜occludin、ZO-1 mRNA表达.结果:IFN-γ主要表达于黏膜固有层中性粒细胞、单核细胞,而occludin、ZO-1主要表达于肠上皮细胞.UC组结肠黏膜IFN-γ蛋白表达较正常对照组显著升高(P=0.000),且活动期显著高于缓解期(P=0.004).UC组结肠黏膜occludin、ZO-1蛋白和mRNA表达均较正常对照组显著降低(P＜0.05),但不同疾病活动期组间差异无统计学意义(P＞0.05).IFN-γ蛋白表达与occludin、ZO-1蛋白表达均呈负相关(rs=-0.794和rs=-0.820,P均＜0.05).结论:IFN-γ可能通过下调紧密连接蛋白occludin、ZO-1表达,引起肠黏膜屏障功能损害,从而参与UC的发生.
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美沙拉嗪对溃疡性结肠炎患者肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响
背景:溃疡性结肠炎(UC)是一种较常见的消化道疾病,其病因和发病机制尚未完全阐明,治疗缺乏特异性方法,导致病情迁延反复.目的:探讨美沙拉嗪治疗对UC肠道紧密连接蛋白的影响.方法:选取2010年12月～2011年6月南京医科大学附属南京医院收治的活动期UC患者30例,给予美沙拉嗪1.0 g tid治疗8周.治疗前后患者行结肠镜检查取活检,以免疫组化法检测治疗前后紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达.结果:美沙拉嗪治疗后UC患者内镜下均取得缓解.免疫组化结果显示,治疗后UC肠黏膜上皮细胞中occludin蛋白(7.20±1.55对1.60±0.55)、ZO-1蛋白表达(6.60±1.26对1.40 ±0.55)显著高于治疗前,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:美沙拉嗪可能通过上调紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达来保护肠黏膜屏障功能.
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β-石竹烯对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的保护作用
目的 观察β-石竹烯在局灶性脑缺血再灌注损伤模型中对大鼠血脑屏障的影响.方法 采用中动脉栓塞法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,分别设假手术组、模型组、β-石竹烯组(34、102、306 mg· kg-1)和尼莫地平(4 mg·kg-1)组.2,3,7-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法测定大鼠的脑梗死体积,伊文思蓝法观察大鼠血脑屏障通透性的改变.免疫组化法观察缺血核心区皮质水通道蛋白-4(AQP-4)的阳性表达.Western blot法检测缺血核心区claudin-5水平变化和occluding的表达.结果 再灌24 h后,β-石竹烯组较模型组可不同程度地改善神经缺损症状,降低神经行为学评分,减小脑梗死体积,减少缺血侧EB含量,减少AQP-4的表达,增加claudin-5和occluding的表达(P＜ 0.05,P＜ 0.01).结论 β-石竹烯可通过减少AQP-4的表达,上调claudin-5和occluding的表达来减轻脑缺血再灌注所导致的脑水肿,降低血脑屏障损伤.
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闭合蛋白表达异常与相关皮肤病
皮肤屏障由角质层、细胞间质和紧密连接组成.闭合蛋白是构成紧密连接的主要蛋白之一,存在于哺乳动物的皮肤、脑、神经系统和内脏组织中,在生理状态下影响紧密连接的整体性及其功能,是构成皮肤栅栏和屏障的主要功能蛋白之一.在人类组织中已发现27种闭合蛋白亚型,在上皮细胞间形成对电解质及溶质分子的屏障结构.研究表明,皮肤屏障功能受损是多种皮肤病如银屑病、特应性皮炎、家族性良性天疱疮、光线性角化病等重要的发病因素,这与闭合蛋白功能和结构的异常密切相关.闭合蛋白家族中不同成员在不同皮肤病中的表达各异.
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特应性皮炎患者皮肤屏障与水闸蛋白1表达的相关性研究
目的 研究特应性皮炎(AD)患者皮肤屏障功能情况,并分析其与水闸蛋白1(claudin-1)表达的相关性.方法 纳入AD患者和健康人各1 1例.应用皮肤经表皮失水率测定仪和皮肤高频超声检测仪测定受试者经表皮失水率、表皮厚度与表皮致密度,并用双抗体夹心ELISA法定量检测血清中脱落claudin-1表达量.应用单因素方差分析和t检验比较不同组别之间相关参数的差异;应用Pearson相关系数分析不同参数之间的相关性.结果 AD患者皮疹部位经表皮失水率为(36.9±34.2) g·m-2·h-1,非皮疹部位为(9.1±6.0) g·m-2·h-1,均高于健康对照[(4.4±3.1)g·m-2·h-1];AD患者皮疹部位表皮厚度(0.23±0.04) mm,显著高于非皮疹部位[(0.18 ± 0.03) mm]和健康对照[(0.18±0.02) mm].AD患者皮疹部位有其特征性表皮下低回声带.AD患者claudin-1表达量为(0.80±0.88) ng/ml,显著低于健康人[(1.73±1.85) ng/ml];claudin-1与表皮厚度显著负相关(r=-0.61),与经表皮失水率的倒数显著正相关(r=0.44).结论 AD患者损伤的皮肤屏障功能与claudin-1表达相关,屏障功能状态可用经表皮失水率、经表皮失水率倒数和表皮厚度进行定量表述.
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肠上皮细胞损伤模型中细胞自噬对Caco-2细胞紧密连接蛋白表达的影响
目的 探讨脂多糖(LPS)诱导肠上皮细胞损伤模型中,肠上皮细胞自噬对肠上皮Caco-2细胞紧密连接(TJ)蛋白表达的影响.方法 在人肠癌细胞系Caco-2细胞中建立LPS诱导肠上皮细胞损伤模型,细胞分为空白对照组(A组)、单独的LPS处理组(B组)、LPS+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(C组).以电阻仪分别检测3组Caco-2细胞跨上皮电阻(TER)值;通过检测荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-dextran)透过率,分别观察3组细胞的细胞间通透性;以Western blot方法检测3组细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、肠上皮细胞TJ蛋白Zonula occluden-1(ZO-1)、claudins-2(CL-2)、occludin(OC)的表达水平;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测肠上皮细胞CL-2、ZO-1和OC mRNA表达.结果 C组在各时点TER值较A、B组明显降低(F=83.82～271.83,P＜0.05);C组细胞间FITC-D4的透过率高于A、B组(F=724.92,P＜0.05);C组的LC3Ⅱ蛋白表达低于A、B组(F=134.72,P＜0.05);C组与B组相比CL-2蛋白表达增加,ZO-1和OC蛋白表达降低,差异均有统计学意义(F=90.03～329.08,P＜0.05);RT-PCR检测结果显示,C组CL-2 mRNA较B组表达增加,而ZO-1和OC mRNA表达降低,差异均有统计学意义(F=339.81～580.32,P＜0.05).结论 在LPS诱导肠上皮细胞损伤模型中,肠上皮细胞自噬可能降低肠上皮细胞CL-2表达,提高ZO-1和OC表达,以此维持肠上皮细胞TJ作用,从而保护肠上皮屏障.
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植酸对结直肠癌模型大鼠zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达的影响
目的 观察不同剂量植酸干预对结直肠癌模型大鼠zo-1、occludin和claudin-1蛋白表达的影响,探讨植酸对结直肠癌大鼠肠黏膜屏障的作用.方法 将60只Wistar雄性大鼠按体质量随机区组分为正常对照组(NC组)、模型组(MG组)、植酸低剂量组(PL组)、植酸中剂量组(PM组)和植酸高剂量组(PH组).PL、PM和PH组大鼠每天分别给予0.25、0.50和1.00 g/kg的植酸钠灌胃,NC和MG组大鼠以等体积的生理盐水代替.从实验第5周起,除NC组外,其余各组大鼠于颈背部注射剂量为30 mg/kg的二甲肼,持续18周,期间NC组大鼠于颈背部注射等体积的生理盐水.继续植酸钠灌胃至实验第39周末,处死大鼠.取NC组大鼠结肠组织及其他组大鼠结直肠肿瘤组织,采用免疫组化方法检测zo-1和occludin蛋白的表达,采用Western Blot方法检测claudin-1蛋白的表达.结果 MG组大鼠结直肠肿瘤发生率为100％,PL、PM、PH组大鼠结直肠肿瘤发生率分别为100％、88.9％和66.7％.与NC组比较,MG组大鼠zo 1和occludin蛋白的表达明显降低(F-23.118、52.886,t=9.041、13.050,P＜0.05);与MG组比较,PL、PM、PH组大鼠zo-1和occludin蛋白的表达显著升高(t=2.385～8.611,P＜0.05).与NC组比较,MG组大鼠claudin-1蛋白的表达明显升高(F=67.159,t=14.028,P＜0.05);与MG组比较,PM和PH组大鼠claudin-1蛋白的表达显著降低(t=2.635、8.421,P＜0.05).结论 植酸可以通过调节zo-1、occludin和claudin-1蛋白的表达来改善肠黏膜屏障,从而抑制结直肠癌的发生.
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抑制Claudin-3表达对体外培养鼠视网膜神经节细胞的作用研究
目的 观察腺相关病毒(AAV)介导小发夹RNA(shRNA)干扰抑制Claudin-3表达对体外培养小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的影响.方法 原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组.细胞接种24 h后,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC分别转染AAV-shScramble和AAV-shClaudin3.转染96h后,活细胞荧光动态显微镜观察目的病毒转染效率;β-微管蛋白免疫荧光染色检测RGC轴突长度;免疫荧光4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察RGC凋亡形态;实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平.结果 活细胞动态荧光显微镜观察发现,AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC病毒转染效率均＞50％;病毒转染96 h后,AAV-shClaudin3组RGC轴突长度明显低于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=2 363.274,P＜0.05);AAV-shClaudin3组RGC密度较正常对照组、AAV-shScramble组明显减低,可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体.AAV-shClaudin组RGC的Claudin-3、VEGF mRNA表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=257.408、160.533,P＜0.05).AAV-shClaudin3组RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显低于正常对照组和AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=129.671、420.552、62.669,P＜0.05);Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组、AAV-shScramble组,差异有统计学意义(F=231.348,P＜0.05).结论 AAV介导shRNA干扰抑制Claudin-3的表达可下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达,促进RGC凋亡,抑制RGC轴突生长.
关键词： 视网膜神经节细胞/生理学 紧密连接蛋白质类 RNA 小分子干扰 动物实验
