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PUMA蛋白结构与功能研究进展
目的:总结PUMA蛋白的结构与功能、促凋亡及其转录调控的作用机制,介绍PUMA蛋白参与线粒体自噬、翻译后磷酸化调控及与之相关的信号通路等新研究进展.方法:应用PubMed及CNKI期刊等全文数据库检索系统,以“p53上调凋亡调制物(PUMA)、凋亡和肿瘤”等为关键词,检索2002-2012年的相关文献.共检索到英文文献108篇,中文文献12篇.纳入标准:1)PUMA的基本特性；2)PUMA的促凋亡机制；3)PUMA的调控,包括转录调控和翻译后调控；4)PUMA的信号通路及调节因子.根据纳入标准符合分析的文献27篇.结果:PUMA通过BH3结构域的绑定功能发挥促凋亡作用及参与线粒体自噬；PUMA的调控机制主要有转录水平的调控(p53依赖/非依赖途径)及新发现的翻译后磷酸化调控机制；一系列PUMA新的调节因子和信号通路的发现,可以为治疗肿瘤的新抗癌药物提供依据.结论:通过对PUMA蛋白的结构与功能及其调控机制的进一步研究,将为人类肿瘤的诊断和治疗提供新的途径与方法.
关键词： 肿瘤 p53上调凋亡调制物 细胞凋亡 综述文献 -
突变型PUMA(S10A)对Hela细胞的凋亡作用及其分子机制
目的 观察突变型PUMA和野生型PUMA对Hela细胞在促凋亡及抑制肿瘤细胞增殖方面的生物学功能差异,并探讨导致这些差异的分子机制.方法 实验随机分为:空载体质粒组、野生型PUMA组、突变型PUMA 3个实验组,应用脂质体转染方法分别将空载质粒、野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒转染Hela细胞中,转染24、48 h后用实时定量PCR和Western blot法检测各组PUMA表达情况;野生型实验组和突变型实验组分别加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮后,Western blot法检测PUMA蛋白的表达;MTT及流式细胞术检测野生型PUMA与突变型PUMA对细胞增殖抑制和促凋亡作用.结果 在相同转染效率的情况下,通过Western blot法分析野生型PUMA组和突变型PUMA组的表达水平,结果表明突变型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一个更高的稳定状态.转染24 h后诱导表达野生型和突变型的PUMA细胞中均加入放线菌酮,结果表明,突变型PUMA蛋白降解延迟、半衰期延长;光密度值测定结果显示细胞转染两种质粒后,细胞存活率随着时间的延长逐渐下降,且转染突变型PUMA质粒在24、48 h的存活率均比野生型PUMA组低(P＜0.05,P＜0.01);流式细胞术结果显示,随着PUMA转染时间的增加,野生型和突变型两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高,并且突变型组细胞比野生型组细胞的凋亡率增加更加明显(P＜0.05,P＜0.01).结论 PUMA具有抑制Hela细胞增殖、促进其凋亡的作用,而其10号位的丝氨酸被丙氨酸取代后增加了突变型PUMA的稳定性、延长了其半衰期,导致突变型比野生型PUMA对Hela细胞的抑制作用及促凋亡功能得到加强.
关键词： p53上调凋亡调制物 定点突变 蛋白稳定性 细胞凋亡 Hela细胞 -
突变型PUMA质粒的构建及表达
目的 构建促凋亡基因p53上调凋亡调制物(PU-MA)的真核表达载体和针对其磷酸化位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因,并克隆到plRES2-EGFP载体上,构建PUMA真核表达载体plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,行PCR及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞,同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组(4个实验组)；PI染色观察PUMA对细胞的促凋亡作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率；RT-PCR检测PUMA的表达；Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达.结果 经PCR及测序结果表明,正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒,PUMA基因第10位氨基酸的第28 ～ 30位碱基由丝氨酸(TCC)突变为丙氨酸(GCC),其他碱基均无突变；野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光,而PI染色观察到野生型、突变型PUMA对Hela细胞的促凋亡作用；流式细胞术检测结果显示突变型和野生型PUMA转染组凋亡率高于阴性对照组和空载体转染组；Western blot和RT-PCR检测出目的基因的高表达.结论 成功构建了PUMA基因及其定点突变载体,为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定基础.
关键词： p53上调凋亡调制物 pIRES2-EGFP 定点突变 真核表达载体
