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大鼠κ-HA-pIRES2-EGFP的构建及表达
目的 构建带HA标签的大鼠κ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(κ-HA-pIRES2-EGFP),并实现其在HEK293细胞中的表达.方法 提取大鼠脑组织总RNA,通过巢式RT-PCR扩增κ型阿片受体全长cDNA,将其克隆至pMD20-T载体中并进行测序鉴定,通过PCR引入HA标签,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的κ-HA-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测κ-HA表达.结果 测序及酶切结果表明成功获得带HA标签的κ基因,并构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下可观察到转染细胞内有绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 利用巢式RT-PCR等技术成功构建了κ-HA-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达.
关键词： κ型阿片受体 巢式PCR pIRES2-EGFP HEK293 -
preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达
目的 研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性.方法 依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174),HBsAg2(1-245),HBsAg3(1-294),HBsAg4(1-341),HBsAg5(1-373),HBsAg6(1-400),终累加成一条连续的长链状态,贯穿在细胞内外形成四次跨膜区,并以此6个片段为模板设计6对引物.从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1,S2基因,采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+ HBsAg(1 ～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP,构建含有Pro-UK,6 × His,preS1,preS2,HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1 ～6)-HA,该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白.采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞,经G418加压筛选阳性克隆,并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达.结果 PCR结果显示,电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600,810,957,1098,1194和1275 bp理论值.酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致.转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1 ～ HBsAg6的293细胞,呈亮绿色,细胞形态良好,荧光表达强度高;Western印迹结果显示,在相对分子质量31 000,34 000,44 000,47000,54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号,条带清晰并与理论值相一致.结论 成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体,并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系.
关键词： 真核表达载体 pIRES2-EGFP 乙肝外膜蛋白 293细胞 -
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞
背景:骨形成蛋白2是骨基质中重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因.目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子牛物学实验室完成.材料:良种新两兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2.EGFP.BMP-2由奉校分子生物学实验室构建、保存.方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞.采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性.结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞.呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达.转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112 kb条带,大小与预期相符合.Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物.免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号.结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达.
关键词： 兔 骨髓干细胞 pIRES2-EGFP 骨形成蛋白2 -
α1,3-岩藻糖基转移酶VII真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建并鉴定绿色荧光蛋白为报告基因的pIRES2-EGFP-FUT7真核表达载体.方法 采用RT-PCR方法获得α1,3-岩藻糖基转移酶VII(FUT7)全长基因,克隆至pMD18-T Simple载体后,将FUT7亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体并进行鉴定.结果 测序及酶切鉴定证明获得人全长FUT7基因,FUT7基因正确插入pIRES2-EGFP中.结论 成功构建了绿色荧光蛋白为报告基因的FUT7真核表达载体,为研究FUT7及其合成的糖抗原sLex在乳腺癌转移中的作用奠定了基础.
关键词： FUT7 sLex 真核表达载体 pIRES2-EGFP -
阿片受体μ-Myc-pIRES2-EGFP的构建及其在CHO细胞中的表达
目的:构建带Myc标签的大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(μ-Myc-pIRES2-EGFP),并实现其在CHO细胞中的表达.方法:以含大鼠全长μ阿片受体基因的μ-pMD20 T载体为模板,通过引物设计和扩增,在μ基因C端引入Myc标签,AT克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的μ-Myc-plRES2-EGFP转染入CHO细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测μ-Myc的表达.结果:测序及酶切结果表明获得带Myc标签的μ基因,构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹观察到目的基因表达.结论:成功构建了μ-Myc-pIRES2-EGFP表达质粒,并在CHO细胞中实现了高效表达.
关键词： μ型阿片受体 pIRES2-EGFP CHO -
人CD160基因转染细胞株的建立及其生物学特性的研究
目的 克隆人CD160基因,并构建含有该目的基因的pIRES2 - EGFP重组质粒载体,获得稳定表达CD160分子的基因转染细胞.方法 从人外周血cDNA文库中扩增CD160的基因,另以VSIG4基因的cDNA为模板扩增跨膜区基因片段,将它们一并装入pIRES2 - EGFP质粒载体中,脂质体法共转染L929细胞,用G418筛选出能稳定表达CD160分子的L929细胞株.结果 成功克隆出了CD160的基因,构建了pIRES2 - EGFP/CD160TMv质粒载体,并建立了稳定表达人CD160分子的L929转基因细胞株,该转基因细胞能结合L929/HVEM转基因细胞,证明其功能性.结论 构建了含人CD160基因的重组pIRES2-EGFP质粒载体和建立稳定表达人CD160分子的细胞株,为CD160分子的后续研究奠定基础.
关键词： CD160 pIRES2-EGFP 基因转染 L929细胞 -
突变型PUMA质粒的构建及表达
目的 构建促凋亡基因p53上调凋亡调制物(PU-MA)的真核表达载体和针对其磷酸化位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因,并克隆到plRES2-EGFP载体上,构建PUMA真核表达载体plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,行PCR及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞,同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组(4个实验组)；PI染色观察PUMA对细胞的促凋亡作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率；RT-PCR检测PUMA的表达；Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达.结果 经PCR及测序结果表明,正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒,PUMA基因第10位氨基酸的第28 ～ 30位碱基由丝氨酸(TCC)突变为丙氨酸(GCC),其他碱基均无突变；野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光,而PI染色观察到野生型、突变型PUMA对Hela细胞的促凋亡作用；流式细胞术检测结果显示突变型和野生型PUMA转染组凋亡率高于阴性对照组和空载体转染组；Western blot和RT-PCR检测出目的基因的高表达.结论 成功构建了PUMA基因及其定点突变载体,为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定基础.
关键词： p53上调凋亡调制物 pIRES2-EGFP 定点突变 真核表达载体 -
HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定
目的:构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒(HBV)HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.方法:采用PCR法扩增HBcAg基因,并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个Nhe I酶切位点,然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoR I和BamH I之间.同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因,并在其两端分别引入Nhe I酶切位点,通过酶切、连接,将这段基因插入到HBcAg基因的Nhe I酶切位点上.将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.结果:酶切鉴定示,插入片段大小均与预计相符.测序结果与已知序列结果一致.结论:成功构建了HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.
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大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达
目的 构建大鼠δ阿片受体基因的pIRES2-EGFP表达质粒,并实现其在HEK293细胞的表达.方法 提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增δ受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,经酶切、连接克隆人pIRES2-EGFP中,将获得的δ-pIRES2-EGFP重组子转染人HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP和δ基因表达情况.结果 酶切和测序结果表明δ基因正确构建入 pIRES2-EGFP表达质粒中,转染了重组子的HEK293细胞在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,应用细胞免疫荧光,可以观察到δ基因高强度表达.结论 利用巢式RT-PCR等成功构建了δ-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达.
关键词： δ阿片受体 巢式PCR pIRES2-EGFP HEK293 -
pIRES2-EGFP/Cbfal真核双表达载体的构建及鉴定
目的:构建成骨细胞特异性转录因子Cbfal双表达载体,以期用于成骨的体内、外研究.方法:以含有全长cDNA的pCMV/Cbfal为模板,PCR扩增Cbfal,T-A克隆,酶切亚克隆到pIRES2-EGFP载体上,酶切、PCR及测序鉴定正确后命名为pIRES2-EGFP,脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达后,提取细胞的总蛋白,Western blot检测Cbfal蛋白的表达,以未转染组为对照.结果:酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP/Cbhl载体序列正确,脂质体法转染NIH3T3细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到Cbfal在蛋白水平的表达.结论:pIRES2-EGFP/Cbfal栽体构建成功,可为后续研究奠定基础.
关键词： 成骨细胞 核心结合因子 pIRES2-EGFP 基因治疗 -
重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响
目的克隆人caspase-8催化结构域基因片段,并将其改建成2种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因,转染HeLa细胞,观察重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响.方法用RT-PCR法,克隆人caspase-8催化结构域基因片段,经重组PCR改造,构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因.将其克隆入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pIRES2-EGFP,转染HeLa细胞,用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构.结果用RT-PCR法,成功地克隆了人caspase-8催化结构域基因片段,构建了3种重构型人caspase-8基因及其真核表达载体.转染HeLa细胞后,重构型人caspase-8基因的表达可导致HeLa细胞死亡.结论重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地引起HeLa细胞死亡.
关键词： 重构 人caspase-8 pIRES2-EGFP Hela -
pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定
目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2 (hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting, WB)法检测其转录、表达活性.结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性.结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础.
关键词： 人类 pIRES2-EGFP 骨形成蛋白2 基因
