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慢性乙型肝炎基因治疗研究进展
随着分子生物学尤其是基因工程技术的发展,抗乙型肝炎基因治疗已有了广泛而深入的研究.利用基因重组、反义核酸等技术在细胞甚至分子水平上的研究表明,基因治疗在抗乙肝病毒(HBV),抑制病毒复制等方面有着很好的作用.本文将着重对近年来抗乙肝病毒治疗基因的筛选以及外源治疗基因的载体投递系统方面的研究进展进行综述.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因治疗 治疗基因 转染载体 -
NKT细胞与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染
NKT细胞是近年发现的一类特殊类型的T淋巴细胞,是机体抵抗外来病原微生物入侵的重要天然免疫细胞.肝炎病毒是临床上导致病毒性肝炎、肝硬化甚至肝癌发生的首要病原微生物.近年研究发现,宿主抵抗肝炎病毒(尤其是HBV和HCV)入侵与NKT的天然免疫防御机制密切相关[1].现就自然杀伤T细胞(NKT)在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒诱发肝病发生发展过程中的作用综述如下.
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HBV对IFN-α受体表达及IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-Ⅰ信号敏感性的影响
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对干扰素α(IFN-α)受体表达的影响,以及对IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-I信号敏感性的影响.方法 以HepG2.2.15细胞、HepG2细胞及LO2细胞为细胞模型,采用流式细胞术、Western-blot检测IFN-αR1和IFN-αR2受体的表达;采用Western-blot动态分析IFN-α2b刺激肝细胞核蛋白STAT1的活化;流式细胞术检测IFN-α2b刺激肝细胞MHC-I的水平.结果 流式细胞术、Western-blot法检测结果显示,HepG2和LO2细胞中IFN-αR1和IFN-αR2受体及蛋白表达均显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,HepG2、LO2细胞中核蛋白p-STAT1的表达显著高于HepG2.2.15细胞(P<0.05);3株细胞经IFN-α2b刺激后,MHC-I水平在HepG2、LO2细胞中的表达较HepG2.2.15细胞更高,差异有统计学意义(P<0.01).结论 HBV的持续存在可降低IFN-αR1和IFN-αR2表达,并降低IFN-α/STAT1和IFN-α/MHC-I信号敏感性,推测其可能是导致HBV对IFN-α产生耐药的部分机制.
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116例乙肝病毒外膜大蛋白检测结果分析及其临床意义
目的 分析乙肝患者血清中乙肝病毒外膜大蛋白(LHBs)检测结果并探讨其临床意义.方法 采用酶联免疲吸附实验(EBSA)检测116例乙肝患者血清中LHBs和乙肝病毒标志物(HBV-M),同时采用聚合酶链反应(PCR)检测HBV-DNA.结果 LHBs和HBV-DNA的检出率分别为70.2%和59.5%,两者之间比较无统计学差异(P>0.05).不同HBV血清标志物中HBV-DNA与LHBs的阳性率之间比较无统计学意义(P>0.05).结论 可作为临床上CHB感染诊断的一项辅助检潮指标.LHBs与HBV-DNA的一致性较好,可作为临床上诊断HBV感染和监测HBV复制的一项新的血清学指标.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) HBV-DNA -
五运六气学说在慢性肝病中的应用
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题,是世界范围传染病死亡的主要病因.我国是慢性乙型肝炎高发区,根据2002年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明,我国一般人群HBsAg阳性率为9.09%[1],估计约1.1亿人为慢性HBV感染,占全世界慢性HBV感染者1/3,其中慢性乙肝约3 000万例[2].慢性乙型肝炎病毒感染对病人、家庭及社会都造成了沉重的经济负担,然而就目前的科技水平来说,无论中医或西医对慢性乙型肝炎均无确切疗效,慢性乙型肝炎的治疗仍然是一个亟待解决的难题.中医治疗具有简、便、廉、验的优点,发挥传统中医药的优势在慢性乙肝的治疗上具有很大的潜力."运气学说"在《黄帝内经》中占有重要的地位,是中医传统的思想之一,对后世医家及各个学科产生着重要的影响,探讨运气与辨证施治的问题是非常现实且有深远意义的问题.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 中医药疗法 五运六气 樊正伦+临床应用 -
磷脂爬行酶1对干扰素抑制乙型肝炎病毒(HBV)作用的影响
研究磷脂爬行酶1 (Phospholipid scramblase 1,PLSCR1)对干扰素抑制HBV作用的影响.设计合成PLSCR1特异性小干扰RNA(siRNA),以完全随机序列的阴性小干扰(NCsiRNA)作为对照,转染HepG2细胞,于转染48h后分别检测PLSCR1 mRNA和蛋白水平表达量的变化,筛选出对PLSCR1具有沉默作用的siRNA;将HepG2细胞分为正常对照组和干扰素处理组,将1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因真核细胞表达载体HBV1.3质粒分别与PLSCR1 siRNA或NCsiRNA共同转染HepG2细胞或干扰素处理的HepG2细胞,转染48h后检测各组细胞中PLSCR1 mRNA表达量及培养液上清中HBsAg表达水平.PLSCR1特异性小干扰RNA siRNA911转染后能够显著抑制HepG2细胞中PLSCR1基因在mRNA和蛋白水平的表达;与HepG2细胞对照组比较,干扰素处理组细胞转染HBV1.3质粒、NCsiRNA+ HBV1.3质粒后,细胞培养液中HBsAg表达水平均显著降低(P＜0.05);而PLSCR1 siRNA与HBV1.3共转染IFN处理的HepG2细胞组与共转染HepG2细胞组相比较,细胞培养液中HBsAg的表达水平没有显著差异.提示抑制PLSCR1的siRNA可抑制干扰素的抗HBV活性,提示PLSCR1在干扰素抑制HBV复制中具有重要作用.
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抗乙肝病毒治疗新策略:阻断P-ε相互作用
目前,临床上治疗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)导致的慢性乙肝药物存在应答率低、副作用大和耐药性等缺点,急需寻找抗病毒治疗的新靶点.HBV反转录过程中,反转录酶(P蛋白)和位于病毒前基因组RNA(Pregenome RNA,pgRNA)5'邻近的RNA包装信号(ε)的相互作用(又称P-ε相互作用)非常关键,该相互作用有宿主蛋白如热激蛋白的参与.P-ε复合物形成后,一方面引发反转录的启动,另一方面启动核衣壳的包装.目前封闭P-ε相互作用的策略主要有热激蛋白抑制剂、ε适配子和阻断P蛋白的化合物三个方面,其机制为针对性靶向P蛋白或者宿主蛋白,从而直接或间接地阻断P-ε相互作用.前期,我们首次体外筛选到干扰P-ε相互作用的适配子,体外实验及动物实验均证实,该类适配子强烈抑制HBV复制.总之,P-ε相互作用为抗乙肝研究的临床治疗提供了一个极具吸引力和应用前景的药物靶点,上述三种策略绕过或克服了目前临床上HBV对化疗药的耐药问题,具有较高的应用前景.
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乙型肝炎病毒X蛋白与内质网应激关系的研究进展
乙型肝炎病毒X蛋白是由乙型肝炎病毒X区转录翻译而成的多功能调节因子,与多种肝脏疾病的发生发展关系密切.近有研究表明,内质网应激受到乙型肝炎病毒X蛋白的调控,促进细胞存活.本文就研究现况对乙型肝炎病毒X蛋白和内质网应激的相关性进行总结,以期为进一步研究提供参考.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 乙型肝炎病毒X蛋白 内质网应激 -
人乙型肝炎病毒前表面抗原(preS)基因的突变及其在家蚕细胞中影响表达的研究
为探讨人乙型肝炎病毒(HBV)前表面抗原(preS)基因的表达调控机理,以实现高效表达,利用PCR方法在克隆的preS基因的第2、3位密码子引入同义突变,消除存在于5＇端编码区保守的反向重复序列,将preS基因及其突变形式(MpreS)分别重组到转移载体pBM030,获得pBM-preS和pBM-MpreS.将pBM-preS和pBM-MpreS分别与野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞(BmN),经空斑筛选和杂交证实,分别获得重组病毒rBmNPV-preS和rBmNPV-MpreS.RNA点杂交和ELISA结果表明:虽然在rBmNPV-preS和rBmNPV-MpreS感染的BmN细胞内都转录了preS基因,但仅后者表达出preS蛋白,提示preS基因的表达与基因内部起始区的反向重复序列密切相关.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 前表面抗原(preS) 突变 杆状病毒载体 家蚕 -
应用慢病毒载体携带HBV基因组DNA制备乙型肝炎病毒感染小鼠模型的影响因素分析
应用慢病毒载体构建不同HBV转导质粒,通过高压水动力法尾静脉注射小鼠,比较不同HBV转导质粒、剂量(5μg和10μg)、小鼠品系(Balb/c和C57BL/6)及鼠龄(6周龄和18周龄)对建立HBV感染模型的影响.不同的时间点尾静脉采血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg的表达水平及动力变化,Real-time PCR检测血清及肝组织病毒载量;免疫组织化学法检测肝组织HBcAg的定位与表达.1.3倍HBV基因组慢病毒载体转导质粒(pCS-HBV1.3)优于1.1倍与1.2倍HBV基因组转导质粒(pCS-HBV1.1 or pCS-HBV1.2);pCS-HBV1.3注射Balb/c小鼠后抗原表达维持时间短,抗体出现早;pCS-HBV1.3注射C57BL/6小鼠后,HBsAg、HBeAg抗原表达及血清HBV DNA水平维持时间长;且注射5μg质粒相对于10μg质粒注射小鼠后抗原表达维持时间更长;而6周龄和18周龄小鼠血清均可在较长时间内检测到HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表达,但在注射后35周内,前者的表达量均高于后者;所有注射质粒的小鼠肝组织中均可检测到HBcAg的表达,且在血清HBV感染标志转阴时均可检测到肝内HBV DNA的存在.注射质粒的HBV基因组长度、剂量以及宿主的遗传背景均对建立乙肝成体转基因小鼠模型有影响,且发现以5μg含1.3倍HBV基因组的转导质粒pCS-HBV1.3注射6周龄C57BL/6小鼠,HBV抗原表达和HBV DNA水平维持时间长,更适合建立HBV持续感染模型.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因组 水动力法 持续感染 动物模型 -
福建省慢性HBV感染者HBV基因S区、基本核心启动子区和前C区基因变异特征分析
为研究福建省慢性HBV感染者HBV基因多样性及变异规律,了解该人群HBV-DNA的病毒学特征.收集慢性HBV感染者血清标本,通过巢式PCR法扩增其HBV基因序列,比对NCBI数据库中标准基因型序列,分析HBV基因S区,基本核心启动子区(BCP)及前C区的序列变异情况,并对这些变异可能造成的病毒抗原表达,疫苗逃逸,患者病症改变等情况进行探讨.终成功扩增82例HBV全长基因序列,其中B基因型56例,C基因型26例.基因组特定功能区序列分析发现慢性HBV感染者HBV基因在S区(23.2％)、BCP区(61.0％)和前C区(29.3％)均出现了不同程度的变异.其中主蛋白(HBsAg)主要抗原决定簇a决定簇45.8％位点出现了变异,这些变异位点中包括与肝炎重症化及免疫逃逸密切相关的位点(aa126、aa129、aa145等).位点G1896A(19.5％),G1764A(11.0％)和A1762T(9.8％)依然是BCP/前C区的主要突变位点.而位点A1752G(25.6％)高突变率的出现在BCP区应引起关注.此外位点G1764A(x2=5.742,P=0.030)、A1896G(x2=14.392,P=0.000)以及A1762T/G1764A(x2=7.289,P=0.012)的突变更容易发生在HBeAg阴性的样品中;而位点A1846T(x2=11.882,P=0.003)、A1762T(x2 =6.561,P=0.038)和A1896G(x2=6.958,P=0.030)的突变与HBV-DNA的病毒载量存在一定相关性.总之,福建省慢性HBV感染者在HBV不同基因功能区域均存在不同程度的变异,一些与HBeAg表达情况、HBV-DNA载量、疫苗免疫逃避及肝细胞癌发生具有相关联的变异位点已经出现,BCP区A1752G位点的高频率出现应值得关注,对于这些变异位点的患者应加强监测.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因变异 基本核心启动子(BCP) 前C区 -
KNK437抑制乙型肝炎病毒复制及转录
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝细胞内复制过程中,病毒反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物,启动反转录合成和核衣壳装配.封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略.已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时,需要热休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)参与.本研究探索Hsps抑制剂KNK437对HBV复制及转录的影响.主要运用了三种工作模型:HepG2.2.15细胞系、瞬时转染1.05×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和瞬时转染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系.采用CCK-8方法检测KNK437的细胞毒性,ELISA测定细胞培养液上清中HB-sAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平;Western blotting检测细胞内衣壳亚单位(core)表达水平;qRT-PCR检测细胞内Hsps本身的转录水平.结果表明:20 μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下调HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成,降低细胞内HBV RNA转录水平,低可使DNA水平降至1.5％左右,RNA水平降至30％左右,从而表明KNK437抑制HBV复制和转录.在HepG2.2.15中的Western blotting显示,KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位(core)表达水平.KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三种热休克蛋白RNA的转录,从而验证了它的确是一种泛Hsps抑制剂.本研究结果显示KNK437具有潜在抗HBV应用前景.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 热休克蛋白(Hsps) KNK437 抑制剂 -
5031例精神病患者乙型肝炎血清学标志物检测结果分析
对我院精神病患者乙型肝炎病毒(HBV)血清学标志物检测结果进行分析,估计其传染性程度,为精神病患者乙肝预防、诊断和治疗提供实验室依据.用ELISA方法检测我院三年来门诊及住院精神病患者乙肝五项指标,并对所有数据进行统计与分析.结果显示,5031例血清标本中检出HBV血清学标志物3023例,总感染率60.1%.血清学标志物模式可分为感染期模式组和恢复期模式组,两组共20种模式.结论:乙肝五项指标检测结果显示,精神疾病患者较同类人群血清总感染率偏高,HBV血清学标志物模式也较为复杂,除HBsAg阳性、抗-HBs阴性、 HBeAg阳性、抗-HBe阴性、抗-HBc阳性组具有传染性外,其他模式也存在一定的传染性.建议对住院精神疾病患者注射乙肝疫苗,以减少乙肝的传染率.
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四种方法检测HBsAg阳性标本对比分析
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行,全球约20亿人感染过HBV[1],约50%的肝硬化和70%～90%的肝癌患者并发HBV感染[2].因此,HBV感染个体的早发现、早诊断、早治疗尤为重要.本文应用金标记免疫层析法(GICA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)等四种方法检测HBsAg,并作了比较,现报告如下.
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乙型肝炎病毒核酸检测降低输血感染残余风险的初步评估
目的 评估衢州地区开展核酸检测技术(NAT)后,无偿献血血液经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测合格后的输血传播乙型肝炎病毒(HBV)残余风险的减少程度.方法 以衢州市中心血站检验科2016年3月至2017年3月期间无偿献血者血液标本为样本,分别采用两种不同厂家的ELISA试剂和一种厂家的NAT试剂检测,用风险评估模型计算HBV的输血残余风险.结果 2016年3月至2017年3月期间共27 646份标本,ELISA检测为阳性,NAT检测也为阳性的标本有76例;ELISA检测为阴性,NAT检测为阳性的标本有31例;NAT检测阳性的标本一共有107例.ELISA检测后的输血HBV残余风险为28.2 × 10-5,NAT检测后的输血HBV残余风险为13.0×10-5.结论 NAT检测可较大幅度地减少HBV的输血感染残余风险,为进一步确保临床输血安全提供有效价值.
关键词： 核酸检测技术(NAT) 乙型肝炎病毒(HBV) 输血残余风险 输血安全 -
两种型特异性引物聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型和亚型的评价
目的 比较并评价本室创建的方法和日本Naito 等建立的乙型肝炎病毒(HBV)型特异性引物聚合酶链反应(PCR)基因分型法.方法 分别用新方法和Naito法检测系列稀释的含有A、D基因型和B1、C2亚型HBV基因组的质粒及不同浓度比例的B1/C2亚型混合质粒,评价两种方法的灵敏度和特异度.此外,用该两种方法分别对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的113份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型,并对该两种分型方法检测结果不一致的血清样本,用PCR产物直接测序法分析.结果 两种方法对单一型别的质粒样本灵敏度无差异,但新方法对B/C混合型质粒样本的灵敏度及对各型别质粒样本的特异度明显优于Naito法.该两种方法检测单一基因型血清标本的灵敏度无差异,但新方法对B/C混合型血清样本的检出率更高.该两种方法检测结果总符合率为83.2%(94/113),不一致率为16.8%(19/113).从两法分型不一致的19份血清标本中,选取15份以PCR产物直接测序法进行分析,结果与新方法检测结果完全一致,而与Naito法不一致.结论 本室建立的HBV型特异性引物-PCR基因分犁法具有较高灵敏度,其特异度也明显优于目前临床上常用的Naito法,适用于HBV 基因型和基因亚型的临床及流行病学研究.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因型 基因亚型 型特异性引物聚合酶链反应 -
10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒X基因表达的抑制作用
目的 以增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告分子,探讨10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3种能针对HBV X基因的特异性10-23DNAzymes,分别命名为DrzHBVX-7、DrzHBVX-8和DrzHBVX-9,能分别特异地识别HBV X基因开放阅读框(ORF)的A1376UG.将内有HBV X全基因片段(不含终止密码)的融合表达质粒pHBx-EGFP与10-23DNAzyme共转染AD293细胞作为共转染组,用pHBx-EGFP单独转染AD293细胞作为对照组,分别用荧光显微镜观察并用流式细胞仪检测细胞荧光强度,同时用半定量一步法RT-PCR分析融合荧光蛋白HBx-EGFP mRNA的相对表达量.结果 各共转染组细胞荧光蛋白HBx-EGFP的表达均明显弱于对照组(P＜0.05);各试验组HBx-EGFP mRNA的相对表达量与对照组比较也均明显减少(P＜0.05);各共转染组细胞之间HBx-EGFP的表达及HBx-EGFP mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 10-23 DNAzyme对HBV X基因的表达有特异抑制作用,在HBV感染的基因治疗中会有潜在的应用价值.
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乙型肝炎病毒核酸载量分析与血清标志物检测的应用评价
目的探讨乙型肝炎病毒核酸载量与血清标志物之间的相关性,进一步明确乙型肝炎病毒血清标志物对肝炎病毒活动情况的评估价值.方法以慢性乙型病毒性肝炎患者为对象,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验同时检测血清乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)和乙肝表面抗原(HbsAg)、乙肝表面抗体(HbsAb)、乙肝e抗原(HbeAg)、乙肝e抗体(HbeAb)、乙肝核心抗体(HbcAb)五项血清学标志物,并对血清标志物进行编码处理.结果2 639例慢性乙型病毒性肝炎患者病毒总检出率为68.17%,病毒载量的平均值为6.015.其中HBeAg阳性组HBVDNA检出率达90%以上,平均病毒载量为6.015.但不同HBVM组合的病毒载量略有差异,以HBsAg、HbeAg两项阳性组为高(8.124),而HBeAg阴性组的病毒检出率和病毒载量均明显低于HBeAg阳性组.结论动态观察乙肝五项编码,对乙型肝炎的诊治和疗效评估具有一定的指导价值.理想的动态趋势是:HBeAg阳性时,编码数值应逐步趋大,至HBeAg转阴后,其编码数值再逐步回落.
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前S1抗原与HBV血清标志物的相关性及临床意义
目的 探讨前S1抗原与乙型肝炎病毒(HBV)血清标志物的相关性及其在临床应用中的意义.方法 用酶联免疫吸咐试验(ELISA法)检测前S1抗原和乙肝两对半,观察不同乙肝模式前S1抗原的表达水平以及乙肝患者在治疗过程中前S1抗原的变化情况.结果 在452例乙肝病毒表面抗原(HbsAg)阳性的血清标本中,“大三阳”、HBsAg加抗-HBc(+)及“小三阳”三种模式的前S1抗原阳性率分别为88.73％、72.04％、60.83％；乙肝病毒e抗原(HbeAg)阳性组的前S1抗原阳性率88.73％,明显高于HBeAg阴性组的64.19％(P ＜0.01);16例经临床治疗HbeAg阴转的患者前S1抗原的阴转率为43.75％(7/16).结论 前S1抗原能较好地反映乙型肝炎病毒的存在与复制情况,有助于对乙肝患者的临床诊断、病情判断及疗效观察.
关键词： 前S1抗原 乙型肝炎病毒(HBV) 血清标志物 -
口腔印模乙肝病毒污染的临床探讨
目的:探讨口腔印模在乙型肝炎病毒(HBV)在医院感染中的作用.方法:同时检测口腔印模标本和外科患者血液标本的乙型肝炎表面抗原(HBsAg),乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA),以确定HBV污染的程度和传染性强度.结果:206份口腔印模标本中8份(3.9%)有肉眼血液,19份(9.2%)HBsAg阳性.HBsAg阳性标本中4份(21.1%)HBeAg阳性,15份(78.9%)HBVDNA阳性.992份外科患者血液标本中156份HBsAg(15.7)阳性.其中31份(19.9%)HBeAg阳性,115份(73.7%)HBV DNA阳性.31份HBsAg和HBeAg双阳性血液标本中,HBV DNA均为阳性,HBV传染性范围为102-109感染剂量/ml.结论:口腔印模受到严重的HBV污染,这种污染可能是医院HBV感染的重要来源.
关键词： 印模 乙型肝炎病毒(HBV) 聚合酶链反应(PCR)
