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人乙型肝炎病毒前表面抗原(preS)基因的突变及其在家蚕细胞中影响表达的研究
为探讨人乙型肝炎病毒(HBV)前表面抗原(preS)基因的表达调控机理,以实现高效表达,利用PCR方法在克隆的preS基因的第2、3位密码子引入同义突变,消除存在于5＇端编码区保守的反向重复序列,将preS基因及其突变形式(MpreS)分别重组到转移载体pBM030,获得pBM-preS和pBM-MpreS.将pBM-preS和pBM-MpreS分别与野生型家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞(BmN),经空斑筛选和杂交证实,分别获得重组病毒rBmNPV-preS和rBmNPV-MpreS.RNA点杂交和ELISA结果表明:虽然在rBmNPV-preS和rBmNPV-MpreS感染的BmN细胞内都转录了preS基因,但仅后者表达出preS蛋白,提示preS基因的表达与基因内部起始区的反向重复序列密切相关.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 前表面抗原(preS) 突变 杆状病毒载体 家蚕 -
SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
导致严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV).SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白已成为SARS研究的主要热点.本文通过构建杆状病毒载体,利用昆虫细胞表达体系,在真核细胞中得到了全长S蛋白,并用恢复期SARS患者的血清对其进行了初步鉴定.这为进一步深入研究SARS-CoV S蛋白与宿主细胞的作用机制、研发SARS疫苗等提供了实验材料.
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重组小鼠Parkin共同调节基因在昆虫细胞系统中的表达
目的:构建小鼠Parkin co-regulated gene(Pacrg)/GFP-pFastBac1重组杆状病毒载体,并在Sf9昆虫细胞中表达. 方法:PCR扩增小鼠全长Pacrg编码cDNA序列,通过TA克隆、连接等方法将该基因插入到携带eGFP的供体质粒pFastBac1中,获得重组载体rpFBac-Pacrg-GFP,然后转化到DH10Bac宿主菌中.筛选获得的重组杆状病毒载体rBacmid-Pacrg-eGFP经脂质体转染至Sf9昆虫细胞中,荧光显微镜及Western印迹检测分析重组蛋白. 结果:经测序及酶切鉴定显示构建的Pacrg/GFP-pFastBac1重组杆状病毒载体正确,Western印迹结果显示PACRG/eGFP融合蛋白在Sf9昆虫细胞中表达且携带绿色荧光. 结论:成功构建了Pacrg/GFP-pFastBac1重组杆状病毒载体,且该重组蛋白在Sf9昆虫细胞中大量表达,为进一步研究PACRG蛋白的结构及其在精子发生中的调控作用奠定了基础.
关键词： Parkin共同调节基因 杆状病毒载体 昆虫细胞 真核表达 精子发生 -
杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1 siRNA对人胰腺癌细胞凋亡的影响
目的:观察杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1(DNA-methyhransferase 1,DNMT1) siRNA(小干扰RNA)对人胰腺癌PaTu8988细胞凋亡的影响.方法:人胰腺癌细胞PaTu8988用6孔板培养并随机分成5组:空白组、阴性组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组).空白组仅加10％胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24 h后,分别加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和重组杆状病毒r-Bac-si-DNMT1-D1、r-Bac-si-DNMT1-D2、r-Bac-si-DNMT1-D3,150 μL/孔.72 h后收集5组细胞,用流式细胞术测肿瘤细胞凋亡,蛋白质印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况.结果:D1组、D2组和D3组的细胞凋亡率明显高于空白组和阴性组(P＜0.05).与空白组和阴性组相比,D1组、D2组和D3组Bcl-2蛋白表达明显降低(P＜0.05),Bax蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论:杆状病毒介导的DNMT1siRNA通过抑制Bcl-2蛋白表达,增加Bax蛋白表达,诱导胰腺癌细胞的凋亡.
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杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1siRNA表达载体的构建
目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响方法:首先将带有BglⅡ和Hind Ⅲ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构建成pSUPER si-DNMT1-D,然后将H1启动子和RNAi序列从上述重组载体切下,插入至同样双酶切的pFastBac1载体,经过转座重组,抽提重组Bacmid DNA,转染草地贪夜蛾细胞Sf9,获得重组杆状病毒Bac-si-DNMT1-D.将上述重组杆状病毒感染胰腺癌PaTu8988细胞系,其中以重组杆状病毒r-Bac-CMV-EGFP作为阴性对照.然后运用荧光定量PCR检测DNMT1基因表达变化.结果:重组杆状病毒能够感染PaTu8988细胞,并且能显著干扰DNMT1基因表达.结论:杆状病毒表达系统可以作为RNAi载体,为以后的基因治疗开辟新的途径.
关键词： 杆状病毒载体 DNA甲基转移酶1基因 RNA干扰 胰腺癌 -
重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究
目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达.方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经AgeⅠ和AccⅠ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western 印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定.结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达.结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础.
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人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达
诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGⅡ4、GGⅡ1和GGⅡ3等为主要的流行遗传型.为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成.以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGⅡ1、GGⅡ3、GGH4和GGⅡ7型衣壳蛋白基因进行了表达.结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒.重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰.这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础.
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HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化
目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.
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杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达
目的重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达.方法用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因及CMV与核因子(NFκB)启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒.分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性.结果由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性.结论重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体.
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乙型肝炎病毒X蛋白对NFκB启动子和增强子反式激活作用
应用杆状病毒穿梭质粒载体与HBV X表达质粒共转染HepG2细胞，研究HBV X蛋白对杆状病毒载体中的NFκB启动子和增强子反式激活作用，作为进一步杆状病毒载体应用研究的基础。
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流感病毒 H7 N9病毒样颗粒疫苗的研发
近，中国出现了由禽源性流感病毒A（ H7N9）引起的严重性传染病，为此全球付出努力，来实现候选疫苗的快速研发。目前，非流感病毒A （ H7 N9） H7亚型流感候选疫苗在面对新近出现的流感病毒A（ H7N9）时，其免疫原性低，保护效果差。一种流感病毒A （ H7 N9）重组候选疫苗，是将A／Anhui／1／2013株的血凝素（ HA ）、神经氨酸苷酶（ NA ）和 A／Indonesia／05／2005（H5N1）株的基质蛋白1（M1）克隆进杆状病毒载体，然后用该杆状病毒感染草地贪夜蛾（ Sf9）昆虫细胞，再从该细胞分泌出由HA、 NA和M1组成的病毒样颗粒（ VLP ），其与成熟的流感病毒颗粒相似。该疫苗从获得H7 N9基因序列进行基因构建到流感病毒A（ H7N9） VLP的分泌，共用了26 d。将该疫苗分别在0 d和14 d接种Balb／c小鼠，用致死野生株进行攻击，以期评价其免疫原性和效力，对照组为非同源性的H7疫苗（ A／chicken／Ja-lisco／CPA1／2012（ H7N3）-VLP ）、A／Indonesia／05／2005（ H5 N1）-VLP 或安慰剂。所有的疫苗添加或不添加 ISCOMATRIX 佐剂。流感病毒 A （ H7 N9） VLP疫苗诱导针对同源性流感病毒A （ H7 N9）的血凝抑制（ HAI ）抗体，滴度≥1∶64。该疫苗对异源的流感病毒A（ H7N3）能产生交叉反应，抑制血红细胞凝集，同时与相应的ISCOMATRIX 佐剂亚组相比，其血凝反应高出3～4倍。类似的，该疫苗的所有剂量诱导的抗NA抗体，与ISCOMATRIX 佐剂亚组相比，其反应高出3～4倍。非同源性的H7疫苗能诱导H7N3和H7N9的HAI ，但不能产生抗N9 NA的抗体。用致死的野生株A／Anhui／1／2013（ H7 N9）攻击小鼠，接种A（H7N9）和A（H7N3）疫苗的小鼠存活率为100％，而接种A （ H5 N1）疫苗和安慰剂的小鼠，存活率为0％。总之，数据表明，重组 H7 N9疫苗研发迅速，免疫原性和效果良好，能够作为大规模流行性感冒H7 N9的候选疫苗用于人体试验。
