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DBO对人慢性髓系白血病细胞K562增殖和凋亡以及自噬影响
目的 DBO(6,8-dichloro-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-1,4-benzoxazine)作为雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂,可诱导人脐静脉内皮细胞发生自噬,促进其凋亡,但是DBO对白血病细胞是否亦具有同样的作用却不明确.本研究旨在探讨DBO对人慢性髓系白血病K562细胞的增殖、自噬与凋亡的影响.方法 常规方法复苏、传代培养K562细胞,设置对照组(DMSO)、DBO处理组.处理24、48和72 h后收集细胞,采用蛋白质印迹法检测LC3蛋白的表达.细胞免疫荧光实验检测LC3斑点的表达;透射电镜观察细胞自噬现象.CCK-8比色法检测K562细胞的活性和增殖能力.细胞周期实验检测K562细胞分裂能力.Annexin V FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡.结果 蛋白质印迹结果显示,K562细胞经雷帕霉素处理后LC3Ⅱ蛋白水平表达升高,p62蛋白水平表达降低;经50 μmol/L DBO处理24、48和72 h后,LC3Ⅱ和p62蛋白水平表达与雷帕霉素处理后结果相似,并呈时间依赖性.K562细胞经10、25和50 μmol/L处理后,LC3-Ⅱ蛋白水平表达升高,p62蛋白水平表达降低,呈剂量依赖性,而使用自噬抑制剂3-MA后LC3Ⅱ蛋白表达降低,P62蛋白表达升高.细胞免疫荧光实验显示,DBO作用72 h后,与对照组相比,DBO处理组LC3斑点的表达量增加.透射电镜观察结果显示,与对照组相比,DBO处理组细胞胞质内可见较多自噬小体和自噬溶酶体,细胞核不规则,染色质边缘化.CCK8检测结果显示,DBO对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用,并呈现时间-剂量依赖性.DBO经10、25、50和100 μmol/L处理24 h的细胞增殖抑制率分别为(0.68±0.05)％、(2.76±0.35)％、(12.64±3.90)％和(22.58±2.41)％,F＝ 67.389,P＜0.001,处理组与对照组之间差异有统计学意义;48 h的增殖抑制率分别为(3.83±1.06)％、(6.23±1.27)％、(15.90±1.10)％和(24.50±2.51)％,F＝ 145.738,P于0.001,处理组与对照组之间差异有统计学意义;72 h的增殖抑制率分别为(8.78±1.28)％、(21.38±1.47)％、(32.11±2.01)％和(34.27±2.59)％,F＝ 225.820,P＜0.001,处理组与对照组之间差异有统计学意义.流式细胞术分析显示K562细胞经DBO处理72 h后,与对照组相比,G2/M期细胞比例增加,x2＝276.706,P＜0.001.流式细胞术分析显示,与对照组相比,K562细胞经DBO处理72 h后的凋亡率增加,x2＝227.384,P50.00l.结论 DBO可明显抑制K562细胞生长,并与自噬和凋亡的发生有关.
