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RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达对小鼠肿瘤免疫机制影响
目的 探讨靶向Notch1的siRNA抑制恶性黑色素瘤Notch通路对小鼠机体抗肿瘤免疫的影响.方法 采用RNA干扰小鼠黑色素瘤细胞B16F1 Notch1基因的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测转染前后肿瘤细胞分泌免疫抑制因子转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的变化.制作小鼠黑色素瘤模型,在肿瘤生长过程中瘤内注射si-Notch1,记录肿瘤生长情况,手术切除肿瘤组织,流式细胞术检测肿瘤组织中gp100抗原特异性CD8+T细胞的比例,ELISA法比较各组肿瘤匀浆上清中IFN-γ和免疫抑制因子TGF-β的含量变化,免疫组化法分析肿瘤组织中FoxP3+Treg细胞的数量.结果 siNotch1转染后,成功下调了黑色素瘤细胞Notch1基因的表达.ELISA实验结果显示,转染后siNotch1组、siNC组和mock组细胞上清TGF-β分泌量分别为(0.665±0.242)、(1.413±0.153)和(1.623±0.111) ng/mL,F=40.237,P=0.000 48;VEGF的分泌量分别为(399.9±79.42)、(397.3±107.0)和(388.6±136.8) ρg/mL,差异无统计学意义,F=0.015,P=0.986;IL-10的分泌量为(38.93±12.45) 、(41.84±9.85)和(45.81±9.36) ρg/mL,差异无统计学意义,F=0.525,P＝0.604.siNotch1瘤内注射之后,小鼠肿瘤生长明显减慢.流式细胞术检测结果显示,siNotch1组、siNC组和mock组gp100抗原特异性CD8+T细胞的比例分别为(5.54±1.68)％、(2.43±1.09)％和(2.57±1.16)％,F＝12.643,P=0.000 25.免疫组化结果显示,FoxP3平均阳性细胞数分别为23.13±6.75、38.63±10.68和41.75±12.10,F=7.802,P=0.003.肿瘤组织匀浆ELISA结果显示,siNotch1组、siNC组和mock组IFN-γ的浓度分别为(10.047±1.775)、(4.121±1.379)和(3.698±1.253)ng/mL,F＝45.660,P＝0.000 23;TGF-β的浓度分别为(3.738±1.203)、(7.663±2.114)和(7.545±2.080)ng/mL,F=11.687,P=0.000 39.结论 siNotch1抑制黑色素瘤细胞Notch通路后,可以降低其分泌TGF-β的含量,从而降低其对淋巴细胞的抑制作用,增加肿瘤组织中gp100抗原特异性CD8+T细胞的浸润,促进IFN-γ的分泌,降低Treg细胞的比例,增强机体抗肿瘤免疫功能.
