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未知基因KH的真核表达载体构建及其对细胞增殖的影响
目的构建未知基因KH的开放阅读框架(KH-ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH对细胞增殖的影响.方法采用DNA重组技术构建KH-ORF的表达载体pCI-neo-KH-ORF,通过脂质体法转染COS-7细胞和K562细胞,RT-PCR检测目的基因的表达.采用流式细胞术检测KH-ORF对COS-7细胞和K562细胞周期的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KH-ORF对COS-7细胞增殖速度的影响,生长曲线与乳酸脱氢酶(LDH)活性测定检测KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响.结果(1)KH-ORF在COS-7细胞与K562细胞中获得表达.(2)KH-ORF对COS-7细胞的细胞周期与增殖速度无明显影响.(3)流式细胞术检测显示,KH-ORF使K562/pCI-KH-ORF细胞周期中S期细胞增多;生长曲线显示,KH-ORF促进K562/pCI-KH-ORF细胞增殖;LDH活性测定结果表明,K562/pCI-KH-ORF细胞LDH比活性上升,高于对照组细胞.结论KH基因可能是一个与K562细胞增殖有关的白血病未知基因.
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未知基因KH开放阅读框架真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响
目的:构建未知基因KH的开放阅读框架(open reading frame,ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH的功能.方法:采用DNA重组技术将KH基因片段的开放阅读框架(KH-ORF)亚克隆于表达载体pCl-neo Mammalian Expression Vector,重组为pCI-neo-KH-ORF真核表达体系,脂质体转染K562细胞,RT-PCR检测目的基因KH的表达.采用体外培养技术,通过pCI-neo-KH-ORF质粒转染K562细胞前后的生长曲线和乳酸脱氢酶活性测定观察KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响.结果:KH-ORF在K562细胞中获得表达,对细胞增殖速度有明显影响.结论:KH-ORF表达产物可能是一个与K562细胞增殖有关的功能蛋白质,KH基因可能是一个具有生物学功能的白血病未知基因.
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K562细胞未知基因KH的开放阅读框架在大肠杆菌中的表达
目的:构建K562细胞未知基因KH的开放阅读框架(open reading flame,ORF)的原核表达体系.方法:采用DNA重组技术构建KH基因片段的开放阅读框架(KH-ORF)的表达载体pCI-neo-KH-ORF,热休克法转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导后,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达.结果:经IPTG诱导0.5h后KH-ORF在BL21(DE3)plysS中获得表达,表达产物以包涵体形式存在,分子产量约24kD.结论:成功构建了KH-ORF的原核表达体系,为进一步研究其功能奠定了基础.
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未知基因KH与公共生物信息资源的比较与分析
目的快速分析K562细胞中未知基因KH的结构与功能.方法以mRNA差异显示技术筛选的K562细胞在0.2mg/ml苦参碱诱导前、后3小时的差异基因为研究对象,采用基因片段的碱基序列与Internet网上多种公共生物信息数据库进行比较,分析未知基因KH的结构与功能.结果对其中的4个片段进行序列分析和同源性比较,有3个基因片段与已知蛋白或蛋白酶的碱基序列完全或高度同源;有1个基因片段除与16号染色体高度同源外,与其它数据库均无显著同源性,暂命名KH基因.结论 KH基因可能是苦参碱作用K562细胞后表达量发生改变的候选新基因.
