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大鼠癫痫持续状态后肌醇酶1α介导的内质网应激相关凋亡分子在海马中的表达
目的 探讨肌醇酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE 1α)介导的内质网应激相关凋亡分子在大鼠癫痫持续状态(SE)后海马神经元损伤中的作用.方法 Wistar大鼠按随机数字表随机分为对照组、SE组,SE组根据不同时间点又分为3、6、12、24、48 h组.免疫荧光法观察葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulating protein 78 kd,GRP78)及磷酸化-IRE1α(p-IRE1α)在各组大鼠海马CA3区中的表达；蛋白质印迹检测磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase 12)的表达变化；荧光TUNEL观察各组大鼠海马CA3区神经元凋亡变化.结果 免疫荧光结果显示,对照组仅见少量GRP78、p-IRE1α阳性神经元(分别为6.90％±0.96％,4.60％±1.12％),SE各亚组GRP78、p-IRE1α阳性神经元均增多,SE后12h达高峰(GRP78:87.45％±3.63％,F=356.82,P＜0.05；p-IRE1α:86.90％±3.82％,F=300.80,P＜0.05)；蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,p-JNK、caspasel2在SE各亚组表达均增多,SE后12 h达高峰；同时TUNEL染色在SE各亚组均能检测到海马神经元凋亡,以SE后12h凋共严重,与p-IRE1α、p-JNK、caspase12表达变化一致.结论 大鼠SE后诱发了内质网应激,表现为内质网应激标志分子GRP78表达增加；IRE1α可能通过磷酸化JNK和活化caspase12参与了SE后神经元凋亡损伤.
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利用CRISPR／Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株
目的：利用CRISPR／Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据GenBank中RNase L基因序列，设计RNase L敲除的小指导RNA（ sgRNA）序列，将其克隆到pCas-Guide真核表达载体中，获得pCas指导RNA（ gRNA）载体；设计供体DNA的同源臂序列，通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板，并将其克隆到pBackZero-T表达载体上，获得pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞，用潮霉素B筛选，通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体pCas-gRNA和pBackZero-T-RNase LK，Western印迹和DNA测序结果表明，成功获得5株RNase L缺失的细胞株，为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。
