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NucleofectorTM核转染仪文献资料
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重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究
目的构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3.1his-hTH,与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况.方法应用基因重组技术,将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3.1his真核表达载体,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3.1his-hTH的正确性;将pcDNA3.1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,24h后观察EGFP瞬时表达情况,10d后进行hTH基因RT-PCR,以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测.结果(1)酶切和测序结果均证实pcDNA3.1his-hTH的正确性;(2)细胞转染24h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达,80%以上细胞发出绿色荧光;10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达,免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达.结论成功构建的pcDNA3.1his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达.该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台.
