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垂体腺瘤双重靶向性基因治疗的实验研究
本研究选择GE7基因导入系统,与人生长激素启动子(human growth hormone promoter,hGHp)调控的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVTK)基因组成基因治疗系统,实验观察对垂体腺瘤细胞的治疗作用.
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口腔癌细胞HSV-tk基因的转导及其鉴定
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)是自杀基因的代表。我们将HSV-tk基因转导入口腔癌细胞系Tca8113和ACC-M细胞并对基因转导细胞进行鉴定,以便为体内外及临床前期试验打下基础。 材料与方法:①人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113和人高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M由上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科建立[1,2]。逆转录病毒包装细胞PA317细胞、NIH3T3细胞由上海第二医科大学人类基因治疗中心保存。含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(TK)SN由上海第二医科大学人类基因治疗中心构建。②脂质体介导基因转移: PA317细胞中加入DNA与脂质体混合物1 ml,6 h后,以400 mg/L G418筛选至克隆出现并扩增,命名为PA317TK细胞和PA317LN细胞。③逆转录病毒载体上清液的收集及滴度测定: 收集PA317TK和PA317LN细胞培养上清液。NIH3T3细胞中加入8 mg/L的polybrene和适量病毒悬液,8 h后以G418筛选至克隆出现。根据克隆形成数计算病毒滴度。④肿瘤细胞tk基因的转导:肿瘤细胞中加入polybrene和适量病毒上清液,24 h后,以G418筛选至克隆出现并扩增。⑤PCR鉴定外源基因整合: 细胞总DNA进行PCR:NeoR基因5′端引物为5′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′,3′端引物为5′-CCCGCTCAGAAAGAACTCGTC-3′。⑥RT-PCR检测外源基因表达 TRIzol RNA抽提试剂盒抽提细胞RNA并进行RT-PCR,产物做PCR,β-actin作内参照。⑦安全性检测: 1 μg细胞DNA进行PCR:env基因5′端引物为5′-ACCTGGAGAGTCACCAACC-3′,3′端引物为5′-TACTTTGGAGAG GTCGTAGC-3′。