抗变形链球菌IgY抑制变链菌产酸的实验研究

目的:探索抗变链IgY抗体对变链菌的影响及其防龋的机制.方法:通过产酸试验观察各组IgY使用后对变链菌不同菌株产酸的影响.结果:抗变链IgY抗体对C型、G型及C+G混合变链菌的产酸量的均有影响,随着IgY抗体浓度的升高,其抑制效果逐渐上升(P＜0.05),各组间pH值逐渐增大,佳抑制浓度为1:2,当IgY抗体的浓度达1∶32时,基本无抑制作用(P＞0.05).结论:抗变链IgY可以抑制变链菌产酸.

维吾尔族和汉族不同龋敏感儿童变异链球菌和远缘链球菌的检测

目的 研究维吾尔族和汉族不同龋敏感儿童牙菌斑中变异链球菌和远缘链球菌的检出量,分析变异链球菌及远缘链球菌与不同民族儿童乳牙龋齿发生的关系,为不同民族儿童乳牙龋的防治提供依据.方法 采用T-A克隆技术制备变异链球菌ATCC25175、远缘链球菌ATCC6715、内参基因16S rRNA的质粒标准品,应用SYBR Green I荧光定量聚合酶链反应对变异链球菌和远缘链球菌进行定量检测.结果 维吾尔族儿童高龋组远缘链球菌的检出量高于汉族儿童高龋组[(1.06×105 ±0.43 ×103) copies·μL-1vs(8.29×104±1.20×104)copies·μL-1],差异有统计学意义(P＜0.05),而维吾尔族、汉族儿童高龋组变异链球菌检出量比较差异无统计学意义(P＞0.05),同时维吾尔族和汉族儿童远缘链球菌和变异链球菌的检出量高龋组均高于无龋组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 远缘链球菌可能是维吾尔族儿童乳牙龋高发的危险因素.

远缘链球菌GTF催化活性蛋白及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:在大肠杆菌中表达重组远缘链球菌葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)的催化活性区(catalytic region,CAT)蛋白并制备其多克隆抗体.方法:扩增远缘链球菌OMZ176基因组的CAT区的基因片段,克隆入pQE31载体诱导表达,鉴定表达产物.重组蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体的效价,Western blotting检测抗体的特异性和亲和性.结果:重组质粒成功在大肠杆菌中表达,经抗His tag单克隆抗体免疫印迹法检测,有阳性条带出现,证实重组蛋白有抗原特异性.ELISA测定免疫小鼠所得抗CAT多克隆抗体效价可达到1∶5 000.Western blotting检测证明该抗体有较好的针对CAT蛋白的专一性.结论:GTF区CAT基因原核表达质粒构建成功,表达的融合蛋白具有良好的抗原性.抗CAT多克隆抗体特异性和效价良好,能够满足针对CAT免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为深入研究同时包含变形链球菌和远缘链球菌两种致龋菌的主要抗原的新型防龋DNA疫苗奠定了必要的物质基础.

远缘链球菌6715及其耐氟菌株适应性耐酸能力的比较研究

目的:探讨远缘链球菌6715(Streptococcus sobrinus 6715,以下简称S.6715)及其耐氟菌株的适应性耐酸能力.方法:在含有不同氟浓度的TSA上逐步诱导S.6715产生耐氟突变株(以下简称S.6715-FR).通过测定在各种酸性pH值培养基中预酸化2 h后,能否使S.6715及其耐氟突变株抵抗致死性pH杀伤而存活及存活率,来测定其适应性耐酸能力的有无及大小.结果:S.6715属强适应性耐酸能力类菌株,大生存率9.98%出现在pH5.5预酸化组,其耐氟突变株S.6715-FR亦具有强适应性耐酸能力,大生存率10.55%出现在pH值5.0预酸化组.结论:在亚致死性pH值中生长能引发远缘链球菌6715及其耐氟菌株的某些生理变化,产生适应性耐酸能力,抵抗酸性环境的杀伤.

PCR同时检测变形链球菌和远缘链球菌

目的:建立一种快速、简便地同时检测变形链球菌和远缘链球菌的方法.方法:以变形链球菌Dextranase基因设计引物,用PCR检测变形链球菌群细菌.结果:变形链球菌(血清型c、e、f)的PCR扩增产物为720 bp;远缘链球菌(血清型d、g)的PCR扩增产物为460 bp;道勒链球菌(血清型h)910 bp;仓鼠链球菌(血清型a),鼠链球菌(血清型b)均为1 270 bp.其它异种菌均不能扩增出产物,因此该PCR检测具有高度的特异性.从细菌纯培养物中PCR检测的敏感性为105菌落形成单位(colony-forming units,CFU).结论:PCR 能同时检测变形链球菌和远缘链球菌.该检测方法具有较高的敏感性和特异性,有望运用于临床检测.

猛性龋儿童变链菌分离株耐酸性实验研究

目的:确定猛性龋儿童变链菌和远缘链球菌临床株的耐酸性.方法:采用紫外分光光度计比较猛性龋、非猛性龋、无龋儿童变链菌(各6株)和远缘链球菌(猛性龋儿童6株,非猛性龋和无龋儿童各3株)临床株在体外不同初始pH条件下的生长情况.结果:初始pH 4.5～5.5条件下,各组变链菌生长抑制程度均明显大于远缘链球菌(P<0.05).初始pH 4.5条件下,猛性龋儿童远缘链球菌分离株耐酸性明显强于非猛性龋和无龋儿童分离菌株(P<0.05).结论:远缘链球菌的耐酸性强于变链菌;猛性龋儿童远缘链球菌分离株耐酸性强.

一种噬菌体裂解酶的抗龋作用研究

目的:探讨噬菌体裂解酶ClyR对变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus,S.sobrinus)临床株的杀菌作用.方法:收集重度低龄儿童龋(severe early childhood caries,SECC)患者牙菌斑标本进行厌氧培养,通过菌落形态、生化鉴定、16S rDNA序列分析等方法对获得的临床株进行鉴定.通过细菌浊度A 600的降低和低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)评价ClyR的杀菌效果.透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)初步探究ClyR的杀菌作用机制.结果:从分离得到的菌株中随机挑选10株S.mutans和10株S.sobrinus进行杀菌活性测试,50 mg/L ClyR对8株S.mutans有明显杀菌作用,其MBC范围为125 mg/L至＞1000 mg/L不等;对3株S.sobrinus有杀菌作用,其MBC范围为125～500 mg/L不等.TEM观察结果表明ClyR可在细菌细胞壁上打孔,从而使细菌发生渗透性死亡.结论:ClyR对S.mutans和S.sobrinus均有较强的杀菌作用,但对S.mutans杀菌作用较S.sobrinus强,或许可以作为一种防龋药物应用于临床.

变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组REA的比较分析

目的:利用限制性核酸内切酶(REA)技术,对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较,判定变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后,遗传型是否发生改变.方法:采用REA技术,经多次实验自行确立REA反应体系,对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较.结果:变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株的基因组已发生改变.结论:变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后,已具有自身的遗传特性.

变形链球菌中葡萄糖基转移酶的研究进展

1.前言龋病是发生于牙齿硬组织的感染性疾病,为常见的口腔疾病.龋病的发生主要与变形链球菌有关,这主要是因为它具有产酸和耐酸性,能够合成细胞内多糖(intracellular polysaccharide,ICP)与细胞外多糖(extracellular polysaccharide,ECP),其中细胞外多糖特别是水不溶性葡聚糖(water insolubal glucan,WIG)与合成葡聚糖的葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)已被广大学者公认为致龋的主要因子.变形链球菌有不同的血清型,其中变形链球菌(Streptococcus mutans) c型在人类中的检出率高,高达80%,其次为远缘链球菌(Streptococcus sobrinus,有的文献称之为Streptococcus mutans 6715)为9%[1].

变形链球菌传播和感染的研究进展

变形链球菌群细菌(mutans streptooocci,简称MS),特别是变形链球菌(Streptococcus mutans,简称变链菌)和远缘链球菌(S.sobrinus)是人类主要的致龋菌.预防MS的感染,干扰MS的传播途径,可有效减少这种微生物对人体的危害,因此,确定MS感染源以及探索其传播到易感者的方式,将有助于阻断或延迟MS的传播.近年来,随着以DNA为基础的分子生物学方法的发展,MS在人类传播的研究进展方面迅速,本文就这方面的研究内容作一综述.

远缘链球菌对儿童猛性龋影响的研究--附92例检测报告

目的:研究远缘链球菌在猛性龋与非猛性龋儿童牙面菌斑上的分布和数量,分析其对猛性龋发生、发展的影响,为儿童猛性龋的防治提供依据.方法:设计并合成针对远缘链球菌葡糖基转移酶基因的特异性引物和小沟聚合物探针,对92例儿童猛性龋患者磨牙唇侧菌斑样品进行实时检测,并与相同数目非猛性龋儿童菌斑样品检测结果进行比较.结果:92例猛性龋患儿的菌斑样品中,远缘链球菌的检出率为33%(30/92),对照组则为4%(4/92);差异有统计学意义,P＜0.05.猛性龋组变形链球菌和远缘链球菌模板数比的平均值为5.64,低于对照组的17.61,差异有统计学意义,P＜0.05.结论:远缘链球菌在儿童猛性龋中的检出率高于非猛性龋儿童.

国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌及其耐氟菌株致龋性的影响

目的 了解国产水溶性蜂胶对变形链球菌(S.mutans ATCC 25175,S.m)、远缘链球菌(S.sobrinus 6715,S.s)及其耐氟菌株的生长抑制作用,以及对葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)的影响,探讨一种新的防龋途径.方法 采用小抑菌浓度(MIC)递增法对S.m、S.s进行氟化钠体外诱导耐氟菌株(S.m-FR、S.s-FR),采用液体稀释法观察水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR生长的影响;用酶化学分析方法检测蜂胶对GTF酶活性的影响.结果 水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR MIC分别为0.39、0.78、0.20、0.39 g/L;小杀菌浓度(MBC)分别为0.78、1.56、1.56、1.56 g/L;随着蜂胶浓度增高,葡糖基转移酶活性逐渐降低,6.25、3.13、1.56 g/L与0.78、0.39 g/L 2个浓度之间差异具有统计学意义(P<0.05),各浓度组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 国产水溶性蜂胶能有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的生长,对GTF具有较强的抑制作用.

乳杆菌LGG发酵牛奶或超高温处理牛奶中抗变形链球菌和远缘链球菌特异性抗体的稳定性和活性

004.含远缘链球菌GTF的生物附着性D,L-乳酸乙交脂微粒的免疫应答

[英]/Smith DJ…∥Oral Microbiol Immunol.-2000,15.-124～130本实验通过鼻内、胃肠道或皮下途径给予一种有生物附着性的多聚D,L-乳酸乙交脂(PLGA)GTF微粒,观察其诱导的免疫应答.材料和方法 GTF源于远缘链球菌株6715,经分离培养、亲和层析、FPLC液相层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化而得.PLGA(W/W为75/25)复合体经凝胶渗透层析测定分子量.微粒由10%远缘链球菌GTF和1%明胶与PLGA干混后经高压提炼而成.选鼠龄45d的SD大鼠作研究对象,鼻内免疫组和胃肠免疫组给予GTF明胶/PLGA微粒、PLGA/明胶微粒或GTF明矾,初次免疫4周,每周1次共4次,再次免疫3周,每周1次共3次.皮下注射组在唾液腺附近进针,给予GTF/明胶微粒/PLGA或GTF明矾,共2次.初次免疫后第1、3、7、11周和再次免疫后第1、3、7周分别取尾静脉血和唾液,ELISA测量血清IgG和唾液IgA抗体水平.结果体外实验表明2 h后GTF从PLGA微粒中释放至大值,此时释放的GTF活性占总量的26%.远缘链球菌GTF诱导的唾液IgA抗体水平在鼻内注射后第28天后明显升高.6只鼠中的5只在鼻内给予GTF/明胶/PLGA微粒诱导唾液IgA抗体产生,该鼻内组平均唾液IgA抗体水平是其他胃肠组或皮下组的30倍,并且初次免疫后至少维持10周,仍然显著高于其他组.再次免疫后抗体水平更高,超过初次免疫的抗体峰值后持续约42d.而血清IgG,皮下注射2组诱导的IgG抗体水平均较高.在鼻内给予GTF微粒后,6只鼠中的4只初次免疫后第4周血清IgG抗体水平明显升高,再次免疫后血清IgG抗体水平升高超过10倍,与皮下注射2组水平相近,并且整个实验中,持续该高水平.讨论采用压缩、提取和研磨等技术使GTF进入PLGA微粒中,该制备程序并不影响GTF结构,GTF微粒诱导的免疫包括对某些构象依赖的抗原决定簇的免疫应答.体外实验表明GTF与PLGA结合后酶活性释放仅1/3,故粘膜免疫中PLGA微粒较明矾的GTF剂量高3倍,但微粒中的GTF并不会全部释放出来.本实验中皮下注射PLGA-GTF微粒比皮下注射GTF明矾(前者GTF是后者3倍)诱导的血清和唾液抗体水平均较低,间接表明鼻内注射组中PLGA-GTF微粒释放的GTF水平并不高于可溶性GTF即GTF明矾.鼻内给予PLGA-GTF微粒诱导的IgA抗体水平远远高于其他途径,也较GTF明矾高,这可能是由于肠较鼻/扁桃区域抗原易稀释或快速裂解,隔室现象的程度也可能导致该差异,因为鼻/扁桃体诱导IgA抗体水平较肠相关淋巴组织高,后者更利于诱导抗体在肠的表达.微粒的生物附着性使GTF微粒与粘膜表面接触时间增长,从而使抗原更有效诱导局部免疫应答.鼻内注射GTF-PLGA微粒再次免疫诱导的IgA抗体水平极高,甚至超过初次免疫峰值持续约42 d.说明反复鼻内给予适当抗原诱导免疫应答是可行的.在粘膜或系统途径中鼻内注射GTF生物活性微粒诱导了高和为持久的唾液免疫反应,有希望成为诱导粘膜免疫的又一种有效途径.[陈舟摘刘天佳校]

福尔马林失活的远缘链球菌经扁桃免疫兔后的免疫反应

本实验通过研究经扁桃免疫和肌内注射S.sob-rinus AHT-K后产生的抗体与S.sobrinus抗原结合,比较两种途径抗原成分的异同.材料和方法人口腔分离株S.sobrinus AHT-K(血清型g)福尔马林灭活后制备菌悬液(1010个细胞/ml),腭扁桃体和肌肉注射菌悬液300ml,每组9只兔.另9只兔腭扁桃注射PBS作阴性对照组,每周注射1次,共6周.初次注射后,每周收集唾液1次,通过凝集试验测定抗体效价,使用S.sobrinus超声片段通过ELISA测定免疫球蛋白浓度和抗体特异性,Western杂交分析后,经加热和酶消化处理细菌超声片段,第6周作为抗原注射于兔体内,再作分析.结果和讨论S.sobrinus免疫兔后,两种途径抗S.sobrinus抗体水平均显著升高,其中唾液IgA和血清IgG更为显著.ELISA表明扁桃免疫后第6周,唾液和血清抗体选择性与S.sobrinus AHT-K(血清型g)和血清相关链球菌(血清型a,d和h)反应,肌肉注射第6周,除上述反应外,血清抗体还可与不相关链球菌(血清型b,c,e和f)反应.凝集反应与此结果一致.抗原经加热和蛋白酶消化后,扁桃免疫产生的抗体反应性并无太大变化,而同样处理的抗原肌肉注射产生的抗体反应性下降70%,鼠李糖、半乳糖或葡萄糖可抑制该扁桃途径反应,并且抗原处理后免疫反应降低,提示与扁桃免疫产生的抗体反应的抗原含糖,这些糖抗原可与S.sobrinus特异性链球菌发生特异性反应(S.sobrinus特异性糖),还可与血清型相关的链球菌产生选择性反应(血清型选择性糖).作者认为这些能与经扁桃免疫途径产生的抗体反应的糖抗原可以有效消除S.sobrinus,减少S.sobrinus诱发的龋坏发生,并且有希望与变链S.mutans抗原结合,共同减少诱发龋坏的所有细菌.[陈舟摘 刘天佳校]

小沟聚合物探针实时检测变形链球菌和远缘链球菌

目的寻求一种快速检测变形链球菌(S.mutans)和远缘链球菌(S.sobrinus)的方法,研究变形链球菌群在儿童猛性龋患者口中的分布.方法设计并合成针对S.mutans和S.sobrinus葡糖基转移酶基因(gtf)的特异性引物和小沟聚合物探针(MGB探针),对9株变形链球菌群参考菌株直接提取DNA及扩增纯培养后提取DNA分别进行检测,比较二者检测结果的异同.采集92例猛性龋儿童菌斑样本,用MGB探针进行实时检测.结果采用MGB探针可以特异性地鉴别S.mutans和S.sobrinus,直接检测和扩增纯培养后的定性检测结果完全一致,前者荧光出现的时间略迟.92例猛性龋患儿中S.mutans检出率为96.7%,S.sobrinus检出率为32.6%,所有检出S.sobrinus的菌斑样本均可检出S.mutans.结论采用特异性MGB探针方法可以对菌斑中S.mutans和S.sobrinus进行实时检测,提高检测效率.

幼儿猛性龋病原菌的分离鉴定

目的:确定幼儿猛性龋的优势病原菌,为其防治提供依据.方法:采用细菌分离培养、形态学、生理生化学和DNA G+c UKol%测定方法,对30名2～5岁猛性龋患儿牙菌斑菌丛进行分离鉴定,采样部位为上颌患龋乳切牙龋损部位及邻近健康釉质表面,对照组的非猛性龋和无龋儿童则采集上颌乳前牙唇面颈l/3处的菌斑.结果:猛性龋儿童龋损部位变链菌和远缘链球菌的检出率及两个采样部位菌斑标本中变链菌和远缘链球菌的检出水平均显著高于非猛性龋和无龋儿童(P<0.05).结论:变链菌和远缘链球菌为幼儿猛性龋的优势病原菌.

变形链球菌和远缘链球菌对牙釉质表面显微硬度的影响

目的探讨变形链球菌和远缘链球菌对牙釉质致龋脱矿性的影响.方法测量在TSB培养液中变形链球菌和远缘链球菌对离体牙牙釉质表面显微硬度的影响.结果变形链球菌和远缘链球菌均可使牙釉质表面显微硬度下降,下降率分别为35%和45%,且远缘链球菌组随时间下降高于变形链球菌.结论远缘链球菌对牙釉质的致龋脱矿性高于变形链球菌,且变链菌在pH低环境中的致龋脱矿性受到抑制.

蜂胶涂膜对变形链球菌生长和黏附的抑制作用

目的:观察蜂胶涂膜对变形链球菌生长和黏附的抑制作用.方法:采用纸片琼脂扩散法观察10、25、50 g/L和100 g/L蜂胶防龋涂膜对变形链球菌c型和d型的抑菌作用.以蜂胶涂膜涂布黏附板,置变形链球菌培养液中培养,观察其抗黏附效果.结果:各浓度蜂胶涂膜及基质都能够抑制细菌生长和黏附,且抑菌作用呈现明显的浓度依赖性,100 g/L涂膜组的抑菌效果与1.6 g/L洗必泰溶液无显著性差异(P>0.05).结论:25～100 g/L蜂胶涂膜均可以有效抑制变形链球菌c型和d型的生长黏附.

远缘链球菌中葡萄糖基转移酶催化活性区基因的克隆和初步表达

目的:构建一株高效表达Streptococcus sobrinus 6715 中GTF-Ⅰ催化活性区(含有B细胞表位)多肽的菌株,为抗GTF-Ⅰ的单克隆抗体的检测和防治龋病亚单位疫苗的研究奠定基础.方法:提取基因组DNA,然后用PCR技术扩增出中目的肽段的约1.1 kb编码基因,并将其克隆至表达载体pGEX-4T-1中构建pGEX-gtf表达质粒.该质粒转化大肠杆菌JMl09后获得重组表达菌株.PCR筛选阳性克隆子.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,确定含有pGEX-gtf的大肠杆菌JMl09的表达情况.结果:含有质粒pGEX-gtf的大肠杆菌JM109能够表达GST-GTF融合蛋白.结论:成功扩增目的基因,并且把它定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建表达质粒,并且该表达质粒能在大肠杆菌中进行表达.