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原花青素对变形链球菌耐氟菌株抑菌效果的研究
目的 研究葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)对变形链球菌耐氟菌株生长、产酸及葡萄糖基转移酶(GTF)的影响.方法 选用变形链球菌标准菌株UA159诱导耐氟突变株(UA159-FR),采用液体稀释法测定GSPE对UA159-FR的低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),将UA159-FR接种于含有梯度浓度GSPE的培养基,厌氧培养并测定其生长曲线和pH变化曲线.提取GTF粗酶,Neson-Somogyi法测定还原糖含量,计算酶活性.结果采用SPSS19.0软件包进行数据分析.结果 GSPE对UA159-FR的MIC为1.00g/L,各实验组UA159-FR的生长曲线在生长对数期较对照组低,进入平台期时间延后.各实验组中GSPE对GTF活性的抑制作用相比对照组有统计学意义(P＜0.05).结论 GSPE对UA159-FR的生长、产酸、GTF酶的活性均有抑制作用.
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变形链球菌耐氟菌株对葡萄糖摄取的体外研究
目的探讨变形链球菌发生耐氟突变后摄取葡萄糖能力的变化.方法采用逐步法诱导变形链球菌产生耐氟菌株,用葡萄糖氧化酶法测定不同PH值,有氟和无氟条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中葡萄糖减少量,并与亲代菌株进行比较.结果在氟化物存在时,耐氟菌株糖摄取量大于亲代菌株;耐氟菌株和亲代株在有无氟化物条件下糖摄取量不同,差异有显著性(P＜0.001).结论变形链球菌耐氟菌株具有致龋性;其致龋力大于亲代菌株.
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赤藓糖醇对主要致龋链球菌及耐氟菌株生长和产酸的影响
目的 通过赤藓糖醇对变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株混合菌生长和产酸影响的体外研究,为赤藓糖醇防龋作用的机理提供制论依据.方法 采用小抑菌浓度递增法对变形链球菌(S.mutans ATCC 25175,S.m)、远缘链球菌(S.sobrinus 6715,S.s)进行氟化钠体外诱导耐氟菌株(S.m-FR、S.s-FR),利用液体稀释法配制赤藓糖醇TSB液8个浓度,分别加入含有变形链球菌、远缘链球菌及其耐氟菌株的细菌混悬液48 h,用比浊法观察其对混合菌生长的影响,并用pH计测定培养前后上清液的△pH值.结果 吸光度A值和△pH值实验前后与对照组相比低浓度为12％时差异均有统计学意义(P＜0.05),且随着浓度的升高A值和△pH值均下降.结论 赤藓糖醇能抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株混合菌生长和产酸,并且随着浓度的升高抑制作用增强.
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变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义
目的:检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk是否发生突变并推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响.方法:体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株,根据GenBank发表的变形链球菌dgk基因序列设计引物,对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒并测序.结果:PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段并发现8个碱基发生突变,突变位点分别在904(ATA→ATT)、940(GTG→GTC)、946(GAT→GAC)、952(GCC→GCT)、958(GAC→GAT)、964(CAT→CAC)、976(TTG→TTA)、991(AAG→AAA).提交该序列到GenBank,获得登陆序列号为DQ272517.结论:变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dgk发生点突变并属于同义突变.
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变形链球菌耐氟菌株的筛选及分子鉴定
目的:探讨变形链球菌(S.mutans)获得耐氟性的培养条件及其鉴定方法,为鉴定变形链球菌耐氟菌株提供理论依据.方法:在微需氧条件(95％N2,5％CO2)下,以梯度氟化钠(NaF)浓度对变形链球菌UA159进行培养,获得耐氟菌株.从表现型和基因型上鉴定所培养菌株.观察菌株的表型特征;采用生理生化鉴定和PCR法对该菌株16S rDNA进行克隆鉴定.结果:微需氧(95％N2,5％CO2)条件下培养出耐氟变形链球菌株.形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定,该菌株具有耐氟稳定性,与变形链球菌UA159的16S rDNA序列同源性是100％,确定该菌株为变形链球菌耐氟菌株.结论:变形链球菌耐氟菌株培养条件是微需氧(95％N2,5％CO2)和脑心浸液(BHI)培养基中培养48 h.经NaF诱导的变形链球菌UA159鉴定为变形链球菌UA159的突变株变形链球菌UA159-FR.
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变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株质子移位膜ATP酶活性的比较
目的:通过测定并比较变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株体内质子移位膜ATP酶的活性,以阐明耐氟菌株耐酸能力提高的原因.方法:将变链菌株Ingbritt及其耐氟突变株Ingbritt-FR通过甲苯处理,2个循环的液氮冷冻和37℃解冻,制成透性细胞.将透性细胞悬液加到含有10mmol/L MgSO4的50mmol/L Tris-maleate测试缓冲液中(pH6.0),加温至37℃,再加入5mmol/L ATP(pH 6.0)起动反应.分别于10、20、60min取样,测定样品中水解ATP所释出的无机磷量.采用磷钼酸比色法在紫外分光光度计上进行比色分析(660nm),所得数据采用双因素方差分析.结果:在10、20和60min时,耐氟菌株H+_ATP酶活性分别为308.48、136.67和82.80μmol Pi/g细胞干重/min,显著高于亲代菌株的相应酶活性:104.77,、64.69和30.70(P＜0.01).随时间推移,两类菌株的H+_ATP酶活性均逐渐降低,在酶的作用时间差别上有统计学意义(P＜0.01).结论:耐氟菌株ATP酶活性增高为其耐酸性增高的原因;H+_ATP酶活性及耐酸性的增高将会增加变链菌耐氟菌株的致龋潜能.
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变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株粘附能力的体外研究
目的探讨变形链球菌和远缘链球菌耐氟突变后,其粘附能力的改变.方法用同位素标记方法测定变形链球菌、远缘链球菌亲代及耐氟菌株粘附至唾液包被羟基磷灰石(SHA)表面的粘附量及粘附百分率,并比较两者的粘附能力.结果变形链球菌、远缘链球菌亲代菌株与耐氟菌株间粘附百分率无明显差异(P>0.05);远缘链球菌与变形链球菌相比,其粘附百分率偏低,差异有显著性(P<0.01).结论变形链球菌与远缘链球菌耐氟菌株粘附至SHA表面的能力与亲代野生株无明显区别,提示耐氟菌株的产生不会降低变链菌的致龋性.
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耐氟菌株及其亲代菌株ATP酶基因的DNA测序
目的对变型链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的胞膜ATP酶基因进行DNA序列分析.方法分别制备变链菌株Ingbritt及其耐氟菌株Ingbritt-FR的菌悬液(OD600nm=1.0),经溶菌酶、Lysis消化.按已知ATP酶基因引物设计、扩增ATP酶各片段.将ATP酶基因连接至PUCm-T克隆载体,转化后经限制性内切酶酶切鉴定为阳性克隆.采用DG1G1E检测ATP酶基因, DNA测序试剂盒分析DNA序列.结果耐氟菌株与其亲代菌株的核苷酸序列无显著差别.结论 ATP酶基因改变不是变链菌株耐氟突变的机制.
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远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异
目的 比较远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异.方法 采用逐步诱导法诱导远缘链球菌6715产生耐氟突变株,分别提取耐氟突变株与亲代菌株菌细胞总RNA并分离纯化mRNA,经逆转录获得cDNA后进行抑制性消减杂交(SSH),比较分析两者的基因表达谱;差异片段通过克隆测序并经在线同源性分析(BLAST)获得片段的基因信息.结果 经与GenBank的BLAST比对,确证存在两对差异片段,分属结构基因fruA和SMU.438c.结论 应用SSH技术成功构建远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株基因差异表达的cDNA消减文库,为深入研究其耐氟机制奠定了基础.
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变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dltC突变的检测及临床意义
目的 检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dltC是否发生突变,推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响.方法 体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株,根据GenBank发表的变形链球菌dltC基因序列设计引物,对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒并测序.结果 PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段,并发现dltC基因有1个碱基发生突变,突变位点在8310(A→G).提交该序列到GenBank,获得登陆序列号为DQ272518.结论 变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dltC发生点突变并属于同义突变.
关键词： 变形链球菌 耐氟菌株 耐酸相关基因dltC -
远缘链球菌6715及其耐氟菌株适应性耐酸能力的比较研究
目的:探讨远缘链球菌6715(Streptococcus sobrinus 6715,以下简称S.6715)及其耐氟菌株的适应性耐酸能力.方法:在含有不同氟浓度的TSA上逐步诱导S.6715产生耐氟突变株(以下简称S.6715-FR).通过测定在各种酸性pH值培养基中预酸化2 h后,能否使S.6715及其耐氟突变株抵抗致死性pH杀伤而存活及存活率,来测定其适应性耐酸能力的有无及大小.结果:S.6715属强适应性耐酸能力类菌株,大生存率9.98%出现在pH5.5预酸化组,其耐氟突变株S.6715-FR亦具有强适应性耐酸能力,大生存率10.55%出现在pH值5.0预酸化组.结论:在亚致死性pH值中生长能引发远缘链球菌6715及其耐氟菌株的某些生理变化,产生适应性耐酸能力,抵抗酸性环境的杀伤.
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变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组REA的比较分析
目的:利用限制性核酸内切酶(REA)技术,对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较,判定变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后,遗传型是否发生改变.方法:采用REA技术,经多次实验自行确立REA反应体系,对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较.结果:变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株的基因组已发生改变.结论:变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后,已具有自身的遗传特性.
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国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌及其耐氟菌株致龋性的影响
目的 了解国产水溶性蜂胶对变形链球菌(S.mutans ATCC 25175,S.m)、远缘链球菌(S.sobrinus 6715,S.s)及其耐氟菌株的生长抑制作用,以及对葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)的影响,探讨一种新的防龋途径.方法 采用小抑菌浓度(MIC)递增法对S.m、S.s进行氟化钠体外诱导耐氟菌株(S.m-FR、S.s-FR),采用液体稀释法观察水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR生长的影响;用酶化学分析方法检测蜂胶对GTF酶活性的影响.结果 水溶性蜂胶对S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR MIC分别为0.39、0.78、0.20、0.39 g/L;小杀菌浓度(MBC)分别为0.78、1.56、1.56、1.56 g/L;随着蜂胶浓度增高,葡糖基转移酶活性逐渐降低,6.25、3.13、1.56 g/L与0.78、0.39 g/L 2个浓度之间差异具有统计学意义(P<0.05),各浓度组与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 国产水溶性蜂胶能有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的生长,对GTF具有较强的抑制作用.
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变异链球菌耐氟菌株的致龋能力
长期应用氟化物会导致变异链球菌耐氟菌株的产生，此变异是否导致其致龋能力发生变化，并且对于氟化物防龋是否出现新的影响，国内外学者进行了大量的研究。本文就变异链球菌耐氟菌株的产酸能力、脱矿能力、耐酸能力、黏附能力和糖酵解能力等研究进展作一综述。
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变异链球菌耐氟菌株的研究进展
氟化物作为防龋制剂,其广泛应用可能导致变异链球菌耐氟菌株的产生.为了解变异链球菌耐氟菌株致龋毒力的变化,学者们对其超微结构、黏附力、耐酸性、产酸性及脱矿能力等致龋相关特性进行了研究,并对耐氟菌株的致龋相关基因和其他分子生物学改变予以深入的研究和探讨.本文就此作一综述.
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变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组AP-PCR的比较
目的: 利用随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)技术对变形链球菌、远缘链球菌和耐氟菌株的基因组进行比较判定变形链球菌耐氟突变、远缘链球菌耐氟突变后遗传型是否发生改变.方法:采用AP-PCR技术经多次实验自行确立AP-PCR反应条件对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较.结果:变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株的基因组已发生改变.结论:变形链球菌耐氟突变、远缘链球菌耐氟突变后已具有自身的遗传特性.
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洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制的测定
目的:通过洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制的测定,探讨一种新的防龋途径.方法:将醋酸洗必泰液稀释成不同的浓度,分别加入变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株菌悬液,测得小抑菌浓度(MIC)、小杀菌浓度(MBC).结果:洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株均有抑菌、杀菌作用,4种细菌小抑菌浓度(MIC)均值为338 μg/L,小杀菌浓度(MBC)均值为375 μg/L.结论:洗必泰可有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株生长.
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变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株超微结构观察
目的:探讨变形链球菌和远缘链球菌耐氟突变后,其超微结构变化及氟化物对细菌结构的影响.方法:将变形链球菌和远缘链球菌分为3组: A为正常对照组;B为加氟孵育组;C为耐氟菌株组.透射电镜观察3组细菌的超微结构.结果:与正常亲代菌株相比,加氟孵育后的菌株及耐氟菌株菌体出现不同程度超微结构改变,包括胞浆电子密度减低,细胞肿胀,内容物外溢,远缘链球菌链状结构消失等.结论:变形链球菌和远缘链球菌与氟共同孵育及耐氟突变后,其超微结构发生了改变,表现为自溶活动及解链活动增强.
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变形链球菌耐氟菌株脱矿能力的体外研究
目的:探讨变形链球菌耐氟突变后,其致釉质片脱矿能力的改变.方法:采用原子吸收分光光度计,测定不同氟浓度条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中钙离子浓度,并与亲代菌株进行比较.结果:耐氟菌株脱矿量在无氟化物存在时,小于亲代菌株;而当0.5mmol/L氟离子存在情况下,其脱矿量大于亲代菌株.差异具显著性.结论:耐氟菌株的产生将增加变形链球菌的致龋力.
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变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株蛋白质组SDS-PAGE的比较
目的利用SDS-PAGE技术,对变形链球茵、远缘链球菌及耐氟菌株的蛋白质组进行比较,判定变形链球茵、远缘链球菌耐氟突变后,是否具有遗传性的变异.方法采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对变形链球茵、远缘链球茵及耐氟菌株的蛋白质组进行比较.结果变形链球菌、远缘链球菌耐氟茵株的蛋白区带中有新生带,有缺失带,蛋白表达量上与亲代菌株也有差别,蛋白组成上与亲代菌株有显著差异.结论变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后,已具有自身的遗传特性.
