泊洛沙姆188对体外三维培养脐血单个核细胞向巨核细胞分化的影响

目的 观察泊洛沙姆188(P188)对体外三维(3D)培养诱导脐血单个核细胞向巨核细胞分化的影响.方法 将分离的脐血单个核细胞分别接种于细胞瓶和细胞培养袋中,后者采用WIGGENS摇床模拟生物反应器进行3D培养.在巨核细胞诱导培养基中加入P188体外培养14d,观察细胞形态、计数细胞数并计算细胞存活率,采用流式细胞术观察巨核细胞表面标志表达情况.结果 与采用传统的细胞培养瓶二维(2D)培养诱导巨核细胞相比,2D+P188培养组巨核系CD41+、CD41+/CD61+、CD61+细胞数明显增加(P值均＜0.01);在3D培养中加入P188,细胞体积变大,核形状不规则,胞质含紫红色颗粒,细胞分化更接近成熟.2D培养、3D培养及3D+P188培养组组间巨核细胞表面标志CD41、CD41/CD61、CD61表达水平差异有统计学意义(P值均＜0.01).LSD-t检验两两比较显示,与2D培养相比,3D培养诱导巨核细胞存活率及细胞数均降低(P值分别为0.018、0.027),3D+P188培养组细胞数、细胞存活率与2D和3D培养组比较差异均无统计学意义(P值均＞0.05).而3D培养组巨核细胞CD41/CD61表达水平为(36.30±1.27)％,高于2D培养组的(23.95±1.34)％(P=0.002),3D+P188培养组CD41/CD61表达水平更高[(59.45±1.20)％].结论 3D培养有利于巨核系祖细胞诱导分化,但细胞存活率低,加入P188,细胞生存状态好,且诱导效率更高.

软骨细胞与静电纺丝聚已内酯支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究

目的 采用静电纺丝聚已内酯(polycaprolactone,PCL)支架与软骨细胞复合培养,比较静态和灌流生物反应器培养条件下对细胞增殖及基质分泌的影响.方法 构建PCL支架,自制灌流生物反应器,分离兔软骨细胞,培养后接种于PCL支架,分为灌流培养组和静态培养组.在培养第3、7、14天对支架-细胞复合体行扫描电镜观察,DNA、糖胺聚糖和总胶原定量检测；在培养第14天分析软骨特异性基因表达并观察软骨基质分泌情况.结果 电镜观察PCL支架纤维直径(1.67±0.76) μm,孔径(17.65土7.11)μm,可见支架中软骨细胞黏附生长良好,灌流培养条件下细胞增殖快,且较好地保持了软骨细胞特征形态.在培养第7天,灌流培养组DNA定量高于静态培养组；在培养第3、7和14天,灌流培养组糖胺聚糖定量均高于静态培养组,灌流培养组糖胺聚糖/DNA比值均高于静态培养组.在培养第14天,灌流培养组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因表达增加；软骨分化指数高于静态培养组.在培养第14天,组织学染色可见灌流培养促进细胞的增殖和渗透生长,提高了软骨基质的分泌,并见软骨陷窝样结构.结论 在灌流生物反应器培养条件下,静电纺丝PCL支架与软骨细胞复合培养可促进软骨细胞的增殖和基质的分泌,提高了组织工程软骨的质量.

适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度的研究

目的 探讨适宜组织工程化骨构建的流体剪切力和物质转运速度.方法 对接种人骨髓间质干细胞的多孔β-磷酸三钙支架进行灌注培养.灌流量相同时,对支架上的细胞分别施加1×、2×及3×的流体剪切力;流体剪切力相同时,分别给予3ml/min、6 ml/min和9 ml/min的灌注.细胞增殖采用MTT法,通过检测碱性磷酸酶(alkalilinphosphatase,AKP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OP)、骨钙素(osteocalcin,OC)分泌及细胞外基质的矿化评价组织工程化骨的构建.通过计算流体动力学得出流体剪切力和物质转运速度.结果 灌流量相同时,剪切力2×组细胞增殖活性高;2×和3×组AKP活性及OC分泌高于1×组;第28天时,3×组矿化基质多.流体剪切力相同时,6 ml/min组AKP活性高;第28天时,3 ml/min组OC分泌高,矿化基质多.灌流量相同时,流体剪切力分别为0.004～0.007 Pa、0.009～0.013 Pa和0.013～0.018 Pa;流体剪切力相同时,物质转运速度分别为0.267～0.384 mm/s、0.521～0.765mm/s和0.765～1.177 mm/s.结论 利用接种人骨髓间质干细胞的β-磷酸三钙支架构建组织工程化骨时,0.013～0.018 Pa的流体剪切力及0.267～0.384 mm/s的物质转运速度是适宜的.

甜叶菊芽在辊式生物反应器中的培养及甜叶菊苷的生产

生物反应器在关节软骨体外构建中的应用

近年来,关节软骨退变或缺损的修复仍是临床治疗的热点及难点,尽管临床上尝试了许多新的治疗手段,但远期效果仍不理想.当前,软骨组织工程在种子细胞、支架材料、调节因子、组织构建等方面已取得了巨大的进展[1,2].软骨组织本身的结构特殊性,(无血管和神经,组织构建所需细胞量少,且比较单一,新陈代谢低),决定了其非常适合体外组织工程的构建[3],这都表明了软骨组织工程将有望成为一种永久修复软骨缺损的理想方法.

极具医学价值的转基因克隆猪

近,由中国科学院广州生物医药与健康研究院成功培育出的8头特殊转基因克隆猪开始“生儿育女”.这种克隆猪在特定波长的激发光下可分别发出红、黄、绿、青4种荧光,这是国际上首次获得能同时表达4种荧光蛋白的转基因克隆猪.专家表示,这使其在疾病模型、器官移植、生物反应器等领域的应用前景更为广阔.然而,这种技术会改写未来的生物进化史吗？它会存在什么样的风险？

Vero细胞微载体悬浮培养生产工艺研究

目的:对微载体悬浮培养Vero细胞的生产工艺进行研究.方法:通过调整生物反应器关键参数(转数)来研究并优化微载体悬浮培养Vero细胞工艺.结果:优化工艺后可更好的应用于生产.结论:优化后的工艺可以适用于生物反应器载体悬浮培养Vero细胞的生产.

转基因植物疫苗研究现状

植物作为一种新型的生物反应器,易于转化并能提供廉价的蛋白质,利用植物作为生物反应器生产新型疫苗是一种十分经济有效的途径.本论文阐述了植物生物反应器的优点、转基因植物的表达系统、转基因植物疫苗的实例以及存在的问题.

植物生物反应器生产药物蛋白的研究进展

利用植物生物反应器生产药物蛋白已成为目前研究的热点.随着分子生物学新技术的发展,植物生物反应器将会成为抗体、血液替代品、疫苗生产的有效途径.本文综述了植物生物反应器生产药物蛋白的研究进展,并对提高药物重组蛋白在转基因植物中表达的研究策略进行了探讨.

半仿生中药筛选系统的研制

传统的细胞培养是在方瓶和多孔板中进行的,而这种器皿所提供的环境与体内环境相去甚远.方瓶和多孔板,仅可以维持温度,PH值与容氧水平,而瓶内培养液同外界没有任何联系,即这是一个封闭体系.实际上体内细胞却可以和胞外环境进行着物质交换,这种体内环境和培养环境的巨大差异是造成中药细胞作用研究中常出现伪结果的重要原因.[2～4]而且,传统的培养方式需要人不断地干预,既辛苦又不方便控制,使得在这一步消耗了太多的精力.

骨组织工程用三维灌注生物反应器系统的设计

目的:设计并构建一套骨组织工程用三维灌注生物反应器系统.方法:①明确骨组织工程用生物反应器系统的设计原则.②灌注小室由管状玻璃主体、聚四氟乙烯螺帽以及橡胶O型圈构建组成.整个系统通过铂处理的硅胶管以及三通和四通将3个灌注小室、双向蠕动泵、培养液贮存瓶、废液贮存瓶、接种口和空气滤膜连接构成.③研究生物反应器系统操作程序.④计算细胞/支架结构体内细胞受到的流体剪切力.结果:设计并构建了一套三维灌注生物反应器系统,既可以减轻内外扩散限制,也可以将力学刺激作用于细胞.该系统区别于其他设计的主要特点是:将细胞接种和长期培养整合于一体构建工程化组织;培养基可以完全穿过支架内部;同时,其模块式设计不仅可以增加工程化组织培养的数量,而且可以根据实验目的在不同时间点灵活方便地收获结构体.结构体内细胞所受到的流体剪切力可以根据灌注速率和支架性质进行计算.结论:所设计的三维灌注生物反应器系统在骨组织工程中具有广阔的应用前景,不仅可以构建工程化骨组织用于临床修复骨缺损,而且可以用于研究流体剪切力作用对骨细胞在三维支架中行为的影响.

聚砜膜生物反应器实验系统构建及对重型肝炎患者血浆的影响

背景:人工肝反应器性能的评价通常需要构建一个密闭实验装置模拟生物人工肝支持系统来对反应器内肝细胞的生物功能以及生物反应效率等进行综合评价,对聚砜膜中空纤维反应器的性能进行初步评价对优化生物人工肝支持治疗系统具有一定意义.目的:构建聚砜膜生物反应器实验系统,了解该系统对重型肝炎患者血浆的影响,观察聚砜膜中空纤维反应器作为生物人工肝反应器的可行性. 设计:重复测量实验.单位:第三军医大学西南医院全军感染病研究所.材料:选用7只新生1～7 d中国实验小型猪,雌雄不拘,由第三军医大学实验动物中心提供,许可证号码:F99017实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1试剂盒购自中国晶美生物工程公司;聚砜膜中空纤维反应器订制于中国上海德宏生物材料研究所;Cellco培养循环式人工毛细管培养系统购于美国Spectrum公司;7份重型肝炎患者血浆样本均取自住院慢性重型肝炎患者做血浆置换时分离的血浆.患者均对实验项目知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.方法:实验于2004-01/2005-07在第三军医大学西南医院全军感染病研究所实验室完成.①实验过程:实验前12 h对实验猪进行断乳,清洁皮毛后分离肝细胞.将聚砜膜中空纤维反应器的内腔通过氧和二氧化碳弥散管与培养液贮池和Cellco培养液循环式人工毛细管培养系统连接成为密闭系统,外腔接口用洁净橡胶塞封闭. 用磁力搅动法将分离的肝细胞进行球形体培养,接种到本系统的聚砜膜中空纤维反应器外腔,然后加重型肝炎患者血浆样本200 mL于贮液池中,以80 mL/min的速度在反应器内腔及贮液池中循环.②实验评估:在循环的0,2,4,6 h从反应器内腔各取出2 mL循环液,用谷氨酸脱氢酶-紫外法检测上清中氨的水平,全自动生化分析仪上检测标本中总胆红素的含量,在全自动血凝仪上检测标本的凝血酶原时间,肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1的检测参照试剂盒说明书进行. 主要观察指标:聚砜膜生物反应器系统对重型肝炎患者血浆的血氨、胆红素、凝血酶原时间、肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1的影响. 结果:①血氨、总胆红素、凝血酶原时间检测结果:重型肝炎患者血氨水平持续降低, 0～2 h下降明显,其后血氨水平下降趋势减缓;总胆红素水平持续降低,6 h的总胆红素水平明显低于0 h,差异有显著性意义 (P < 0.05);凝血酶原时间持续降低,6h的凝血酶原时间较0 h降低,差异具显著性意义(P < 0.05).②肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1检测结果:重型肝炎患者血浆的肿瘤坏死因子α及转化生长因子β1含量持续降低,其中6 h均明显低于0 h,差异具显著性意义 (P < 0.05). 结论:砜膜生物反应器实验系统能够清除重型肝炎患者血浆中的小分子有毒物质,补充有益成分,降低细胞因子水平,可作为生物人工肝反应器.

骨髓间充质干细胞-聚乙醇酸支架复合体种植动物皮下构建组织工程化小口径血管

背景:课题组的前期工作已证实骨髓间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞,并证实所诱导的细胞和胶原包埋的聚乙醇酸支架具有良好的组织相容性.目的:探讨利用动物皮下作为生物反应器构建小口径组织工程化血管的可行性.方法:骨髓间充质干细胞诱导分化为血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞,分层种植于胶原包埋聚乙醇酸支架表面,然后将细胞-支架复合体种植于动物皮下,构建小口径组织工程化血管.结果与结论:人工血管组织学观察见管壁结构清晰,其大体结构和天然血管相似,可承受26.6 kPa的血管腔内压力不破裂.皮下培养8周免疫荧光观察Brdu标记的部分细胞核呈现明亮的黄绿色荧光.结果说明利用动物的皮下作为生物反应器,采用静态培养的方式构建小口径组织工程化血管是可行的.

体内生物反应器与体内骨组织工程

近年来,骨组织工程研究在种子细胞、支架材料和构建技术3个主要方面均取得了巨大进展,但复合体外培养细胞的骨组织工程产品临床应用仍面临挑战.体内骨组织工程足以受体自身机体作为生物反应器,单纯应用生物材料而不外加细胞或生长因子,在骨或非骨环境构建形成骨移植物修复自体骨缺损的技术.有关研究显示这是一种调动机体自我再生能力的组织工程新策略,具有切实可行的应用前景.

组织工程化血管构架及构建环境相关研究与进展

目的:介绍组织工程血管的支架材料设计、种子细胞的选择及体外动态培养系统的应用现状及进展.资料来源:应用计算机检索PUBMED 1996/2007与组织工程化血管相关的文章,检索词"tissue engineering,vascular,scaffold,seed cell,bioreactor",限定文献语种为"English";同时检索万方数据库2000/2007相关文章,检索词"组织工程,血管,支架材料,种子细胞,生物反应器",限定文献语种为中文.资料选择:共检索到相关文献200余条,选择与组织工程血管构建、组织工程血管支架材料及其生物相容性研究、种子细胞选择相关的文章,无论观察对象为人或动物、无论是否有对照组均纳入,排除综述和重复文献.资料提炼:根据以上标准共纳入30篇进行综述.其中12篇陈述了血管构架材料,12篇介绍种子细胞选择,8篇论述了构建环境对组织工程血管的影响.资料综合:①根据血管构架的来源和性能,可分为天然生物生材料和人工合成材料,因为2种材料均有其缺陷,目前已有研究将天然材料的重要氨基酸序列接在合成聚合物的表面,形成复合生物材料以克服两种材料各自的缺陷.②选取种子细胞的一种途径是从组织活检中直接捕获成熟的血管壁细胞,来源包括自体的非必须大血管壁细胞及微血管壁细胞;另一种途径就是通过构建具有自我更新、多向繁殖分化能力的干细胞工程来获得相应的种子细胞.③组织工程血管的培养环境应尽可能模仿生物体内血管生发的环境条件.结论:到目前为止,组织工程血管的研究主体仍处于实验阶段,现有的临床应用仅仅是少量的尝试性探索.只有从应力与生长关系出发,摸索出能够成功诱导分化成血管壁细胞的干细胞系,在体外完全模拟出新生血管的相同环境,并解决体内移植的组织相容性等问题,才能形成可生长性、可塑形性和高度顺应性的组织工程血管.

组织工程修复骨及软骨缺损的现状及展望

随着组织工程技术的快速发展,组织工程骨软骨复合组织构建修复骨软骨缺损成为研究热点.骨软骨复合组织的构建仍存在很多难题,还需日臻完善.文章从支架材料设计的种类,包括单层和一体化双层支架;种子细胞的来源和类型,包括自体或异体来源软骨及骨细胞、骨髓基质干细胞和胚胎干细胞;生物反应器技术的应用等方面综述了目前骨软骨缺损修复的研究进展,指出组织工程骨软骨修复骨软骨缺损存在的主要问题,并对日后该方面研究的发展方向提出展望.

生物人工肝的研究与进展

目的:分析近些年来生物人工肝相关的研究,对生物人工肝的发展作一总结.资料来源:以bioartificial liver, liver cell, hepatocyte culture, bioreactor为检索词,检索Ovid、SpringerLink数据库(1990-09/2008-09);以生物人工肝、肝细胞、细胞培养、生物反应器为检索词,检索维普数据库、中国期刊网及万方数据库(1990-09/2008-09).文献检索语种限制为英文和中文.资料选择:纳入有关生物人工肝肝细胞、反应器及辅助装置的研究,排除生物人工肝免疫和动物传染的研究.结局评价指标:①生物人工肝肝细胞的来源、数量及培养方式.②生物反应器的类型及主要结构膜的性质及类别.③生物人工肝供氧及温控装置的构成.结果:计算机初检得到3 898篇文献,根据纳入排除标准,对29篇进行分析.生物人工肝是在体外生物反应器中培养肝细胞,当患者的血液流经生物反应器时,通过半透膜或直接接触的方式与培养的肝细胞进行物质交换,使其中的肝细胞发挥解毒、合成、生物转化等功能,以达到支持和治疗目的.它不但具有解毒功能,而且还能参与3大营养物质代谢,分泌促进肝细胞生长的物质等,可有效替代肝脏的解毒功能和合成功能,并可较好地预防肝性脑病、肝昏迷和脑水肿,临床上可作为肝衰竭患者肝移植前的过渡辅助措施.结论:生物人工肝研究虽然取得了重大进展,但仍然面临寻找理想肝细胞来源,长期维持肝细胞的活性和功能,进一步优化反应器设计等问题.

三维培养人多能干细胞的研究与进展

背景:人多能干细胞具有体外长期自我更新和分化为几乎所有体细胞类型的独特潜能,在细胞治疗、再生医学、药物筛选、毒理学测定、疾病建模和立体器官发生等领域有广泛的应用前景.传统体外二维培养方法难以获得大量的细胞,而三维培养技术为人多能干细胞的大规模生产开辟了一条新的途径.目的:对目前人多能干细胞三维培养的研究进展作一综述.方法:应用计算机检索PubMed和CNKI数据库2005年1月至今有关人多能干细胞三维培养的文章,英文检索词为"human pluripotent stem cells,three dimension culture,microcarrier,suspension culture,aggregates,hydrogel,microencapsulation,bioreactor system,pluripotency",中文检索词为"多能干细胞,三维培养",保留77篇文献进行分析.结果与结论:细胞聚集体、微载体和水凝胶是目前实验室三维培养多能干细胞的主要形式.与二维培养相比,三维培养可更高效地扩增细胞,提高细胞产量,为人多能干细胞临床应用奠定了良好的基础.

组织工程心脏瓣膜的构建：现状与前景

背景：目前临床上应用的心脏生物瓣和机械瓣都存在一些缺陷和不足，而组织工程心脏瓣膜有可能避免这些问题的出现，成为瓣膜替代物的理想选择。
　　目的：探讨构建组织工程心脏瓣膜的实验研究进展。
　　方法：应用数据库检索的方法分析关于组织工程心脏瓣膜的实验研究文献，组织工程心脏瓣膜的三大要素为种子细胞、支架材料和细胞种植。
　　结果与结论：心脏瓣膜修复和置换是目前治疗心脏瓣膜性疾病的主要外科手段。目前，主要用于构建组织工程心脏瓣膜的种子细胞有血管内皮细胞、内皮祖细胞以及骨髓间充质干细胞等。经脱细胞处理的支架具有良好的生物力学性能和组织相容性，细胞种植后支架表面会形成一层连续的细胞层，其构建的组织工程心脏瓣膜是可行的。组织工程心脏瓣膜有着良好的应用前景，但目前还有很多问题需要解决，还处于研究的初级阶段。

肝脏干细胞研究及应用前景展望

背景:近年肝脏干细胞移植治疗终末期肝病得到人们的广泛关注,但临床应用中却面临来源有限,细胞数量不足,移植后干细胞往往弥散、流失,且分化率低,无法有效发挥其修复功能等技术问题制约.目的:总结肝脏干细胞组织工程的研究进展,并展望其应用前景.方法:应用计算机检索1999-01/2010-12 PubMed数据库相关文献,英文检索词"liver stem cell tissue engineering"分别与"three dimensional culture,biodegradable materials,biological reactor"组合,并限定文献语言种类为English.共检索到文献241篇,终纳入符合标准的文献43篇.结果与结论:肝脏干细胞来源有限,而肝脏组织工程需要大量可靠的种子干细胞,三维培养是目前发现行之有效的体外扩增手段.在三维培养条件下,使用不同支架材料和反应器扩增效率及移植效果存在巨大差异,如何确定具有肝脏干细胞特异性的理想扩增条件、改善支架生物相容性以提高移植效率是关键技术问题.未来的研究需要进一步探讨肝脏干细胞特异性扩增生物反应器及肝脏干细胞特异性支架构建等技术难点.