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生物反应器内微载体培养细胞的胰酶消化放大技术
目的 建立生物反应器内微载体上Vero细胞球转球胰酶消化放大技术.方法 用500 ml搅拌瓶培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8× 106个/ml时,加入25和37℃消化液(0.25％胰酶+0.02％ EDTA)消化不同时间,计算细胞回收率及细胞活率,筛选微载体细胞佳培养温度及消化时间.将3L反应器内微载体及T25方瓶培养的Vero细胞消化后接种T25方瓶,比较两种传代方式下的细胞形态及比生长速率.将3L反应器内微载体培养的Vero细胞用消化液消化后,按1∶3、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例接种至15 L反应器,确定适接种比例.将转瓶及3L反应器内微载体培养的Vero细胞消化后接种至15 L反应器,比较两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率.结果 微载体上培养的Vero细胞经25℃消化15 min可有效保证细胞的回收率及活率.两种传代方式下的细胞形态及比生长速率无明显区别.细胞比生长速率在1∶6～1∶10比例放大时较高.两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率无明显区别.结论 初步建立了生物反应器微载体内细胞的胰酶消化球转球放大技术,Vero细胞存活率较高,贴壁良好,空珠率较低,可应用于生物反应器微载体培养系统的规模放大.
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应用篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗(Vero细胞)
目的 探讨篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗(Vero细胞).方法 应用14 L篮式生物反应器,以Vero细胞作为森林脑炎病毒增殖的细胞基质,采用片状载体对Vero细胞进行高密度培养,探讨不同细胞接种浓度对生物反应器内细胞密度及病毒产量的影响.连续收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、1:4 000(v/v)β-丙内酯灭活、柱层析纯化后,获得疫苗原液,按照《中国药典》三部(2010版)进行相关检测.结果 用(5～7.5)× 105个/ml细胞浓度接种Vero细胞培养森林脑炎病毒可连续收获30 d以上,平均病毒滴度为8.4 lgLD50/ml;1:4 000(v/v)β-丙内酯灭活24 h可完全灭活病毒,3批病毒浓缩液灭活验证试验均未检出残余活病毒;柱层析纯化后杂蛋白去除率可达89.56％;疫苗原液经无菌检查合格,其他各项质量指标均符合《中国药典》三部(2010版)规定.结论 应用篮式生物反应器培养Vero细胞制备了合格的森林脑炎灭活疫苗,该工艺适用于森林脑炎灭活疫苗的规模化生产.
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大鼠骨髓间充质干细胞培养浓度的即时监测
目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)培养过程中即时监测细胞浓度的可行性.方法 将6～8周龄的SD大鼠处死,分离MSCs,在24孔板上半连续灌注培养和自制的生物反应器上连续灌注培养,通过实时检测培养过程中的葡萄糖消耗率(Glucose consumption rate,GCR)、乳酸累积率(Lactic acid production rate,LPR)及相应的干细胞浓度,并计算葡萄糖的比细胞得率( qGlu)及乳酸累积比细胞得率(qLac),分析其稳定性及细胞浓度与GCR和LPR之间的关系.结果 所分离培养的MSCs形态均一,轮廓鲜明,呈典型的短小梭形.在24孔板上半连续灌注培养的qGlu和qLac分别为1.84和1.74 mg/(106个·d)；生物反应器连续灌注培养的qGlu和qLac分别为1.66和1.61 mg/(106个·d),二者比细胞得率均为恒值.结论 MSCs培养过程中,GCR、LPR与细胞浓度具有良好的线性关系,通过对葡萄糖浓度和乳酸浓度的测定,可以实时监测MSCs的浓度.
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生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型
目的 研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法.方法 利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较.分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50).结果 采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养.按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍.EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍.结论 已成功建立了生物反应器微载体5L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础.
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生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型
目的 利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16).方法 应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37 ℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度.结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×105个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达高,约7.75 TCID50/ml.结论 成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础.
关键词： 生物反应器 微载体 Vero细胞 柯萨奇病毒A组16型 -
表达TNFR-Fc的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺的放大及其活性检测
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
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生物反应器微载体规模化培养轮状病毒重配株LH9
目的 利用Vero细胞生物反应器微载体培养技术规模化培养轮状病毒重配株LH9(G4型).方法 用3L生物反应器,以4g/L载体浓度培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8× 106个/ml时,分别用含2、1、0.75、0μg/ml胰酶的DMEM培养液,35 ℃连续培养21d,观察细胞生长状态.分别按0.5、0.1、0.05、0.01 MOI接种轮状病毒重配株LH9(G4),培养过程中每日取样,检测病毒滴度以及葡萄糖、乳酸含量.根据培养过程中葡萄糖、乳酸含量的变化,确定病毒培养过程中的收获时间,优化培养工艺.结果 在反应器中用含不同浓度胰酶的DMEM培养Vero细胞,细胞形态良好,与不含胰酶的DMEM培养液培养的细胞无明显差异;按0.05 MOI接种后的病毒收获液滴度较高,可达7.0 lgCCID50/ml,且持续时间较长;通过对病毒培养液中葡萄糖、乳酸含量的监测,调整了培养过程中的收获时间,收获次数增加至4次,可收获病毒液4个工作体积,病毒高峰滴度可达8.5 lgCCID50/ml.结论 采用生物反应器微载体系统培养轮状病毒重配株LH9(G4),可显著提高病毒滴度,通过对培养过程的优化,增加了病毒收获量,为进一步规模化生产轮状病毒疫苗奠定了基础.
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生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒
目的 建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1NI全病毒灭活疫苗的新工艺.方法 利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)％,pH7.2±0.2,搅拌速度(50±20) r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Veto细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定.结果 使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83％,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112％;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液终细胞数达到(133.4±2.0)×104个/mL,含血清细胞培养液终细胞数达到(353.4±5.9)×104个/mL.无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5.用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求.结论 建立了3L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础.
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Vero、CHO和杂交瘤细胞在生物反应器中的生长和代谢
目的研究Vero、CHO和杂交瘤细胞在生物反应器中的生长和代谢.方法应用搅拌式生物反应器,培养了Vero、CHO和鼠杂交瘤7H3细胞,对营养物质及代谢产物进行定量分析,测定各个培养中发酵相关参数.结果培养过程中葡萄糖和谷氨酰胺的摄取与培养液中两者的浓度正相关.控制营养物质的加入可提高细胞产量.结论Vero、CHO和7H3细胞在生物反应器培养中有相同的生长和代谢模式.
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无血清微载体细胞培养的研究进展
微载体技术能够高效大量地增殖细胞,对于在发酵罐中获得高产量的贴壁细胞具有良好的应崩前景.无咀清培养克服了含血清培养存在潜存污染源及不利于下游分离纯化等缺点.在生物制品生产中已得到广泛应用.本文就无血清微载体细胞培养需添加的组分,使用的微载体和生物反应器的种类,细胞新陈代谢的情况及应用前景作一综述.
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30 L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂
目的 应用30 L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA).方法 将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30 L生物反应器中,并采用Biocommand Plus 软件系统实时监控.先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养.在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性.采用Lysine-Sepharose 4B和Zn~(2+)-Sepharose 4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度.结果 整个培养过程持续51 d,包括生长培养6 d,表达培养45 d,平均日灌流量为46.7 L,高达60 L,共收获表达培养液约2 100 L;rht-PA的平均表达水平为15.15 mg/L,高可达19.25 mg/L,生物学活性平均约为8 000 IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达高水平(15.97 g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×10~5 IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上.结论 应用30 L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达.
关键词： 人组织型纤溶酶原激活剂 重组CHO细胞 生物反应器 灌流培养 -
血管生物反应器相关参数的测量与分析
目的 通过对组织工程生物反应器中相关参数的测量,了解培养液的物理化学特性,为控制组织工程产品培养提供理论依据.方法 从反应器中吸取第1、2和3天的培养液,采用旋转黏度计进行黏度及相关参数测量,并分别用葡萄糖分析试剂盒、尿素氮测定试剂盒和乳酸脱氢酶分析试剂盒测定葡萄糖、乳酸和氨的含量.结果 当转速达到稳定时,应力、扭矩、剪切速率和角速度的值基本稳定,不同天数的黏度测量值基本保持在0.8～1.0之间;从葡萄糖、乳酸和氨的代谢可知,葡萄糖在逐渐消耗,乳酸和氨的含量在逐渐增加.结论 不同天数的培养液黏度与牛顿流体的特性非常相似,黏度的变化将引起剪应力的改变.根据葡萄糖的代谢情况,生物反应器中培养的细胞材料复合物的佳换液时间为2 d.
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应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗
目的 应用7.5L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗.方法 应用7.5L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液.经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定.结果 当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2× 107个/ml,病毒滴度平均达8.33 ～ 8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒高滴度可达9.02 lgLD50/ml.经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000 β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果；纯化后可去除90％以上杂蛋白.应用7.5L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求.结论 应用7.5L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗.
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生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗
目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗.方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗.结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22 d,病毒高滴度8.5 LogLD50/ml,平均滴度7.6 LogLD50/ml.经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10 pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5 IU/0.5ml,效力≥4.5 IU/0.5ml.结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗.
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应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗
目的 应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗.方法 以人用狂犬病疫苗株aGV为毒种,Vero细胞为培养基质,利用14 L生物反应器(500g片状载体置于载体篮内)灌流式培养,连续收获的病毒液经超滤浓缩、灭活、柱层析纯化后,加入冻干保护剂,制备冻干人用狂犬病疫苗,检测冻干前后及37℃放置28 d后的疫苗效价.结果 细胞密度高可达1.0×107个/ml;病毒收获液毒力为7.5×106～3.4×108FFU/ml;纯化后总蛋白质含量小于80μg/0.5ml,Vero细胞蛋白质残留量≤3.5μg/0.5 ml,Vero细胞DNA残留量小于100 pg/0.5ml,疫苗效价大于5.0IU/0.5 ml.结论 应用篮式生物反应器可制备高质量的人用狂犬病疫苗.
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生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒
目的 应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒.方法 用7 L、75 L和550 L生物反应器逐级放大培养Veto细胞,每天取样进行细胞计数.在550 L生物反应器巾培养脊髓厌质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度.结果 一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数高;病毒培养体积达350 L,病毒收获液滴度大于7.625 IgCCID50/ml.结论 通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒.
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生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗
目的 建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺.方法 以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15 L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5 g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定.结果 随着微载体浓度的增加,细胞密度升高.采用2.5～4.5 g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56 lgPFU/ml,收获量高可达到12～15个有效罐体积.制备的3批疫苗各项质量指标均符合<中国药典>三部(2005版)相关要求.结论 已建立了15 L生物反应器制备Veto细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础.
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兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化
目的 优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺.方法 建立BHK21 C13细胞主细胞库、工作细胞库,狂犬病病毒疫苗株LEP-Flury主种子批、工作种子批,并进行鉴定.优化悬浮培养工艺参数,并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗原及成品的稳定性.结果 主细胞库、工作细胞库无外源因子污染,细胞形态、生长良好;狂犬病病毒主种子批和工作种子批无外源因子污染,病毒滴度高可达107.8 logLD50/ml.采用15 L生物反应器,在优化的培养工艺条件下,细胞密度可达4.5×106个/ml,病毒按0.3 MOI接种,灌流培养5次,病毒滴度平均可达106.8 logLD50/ml.病毒原液合并后,经750 KD中空纤维柱30倍浓缩,Sepharose Fast Flow 6层析柱纯化,1/4 000 β-丙内酯灭活,期间加入稳定剂,纯化疫苗效价平均达(5.03±1.84)IU/头份,纯化的抗原量达(11.75±0.70)μg/头份,在4℃可保存24个月,在37℃可保存30 d,在45℃可保存12 h.结论 优化的兽用灭活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性.
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人用狂犬病疫苗的免疫效果观察
接种安全高效的狂犬病疫苗是预防狂犬病的有效手段之一.成大速达TM人用狂犬病疫苗是以Vero细胞为基质,采用国家标准毒株PV-2061,利用引进的生物反应器高密度微载体细胞培养技术,经多次纯化制备的无佐剂狂犬病疫苗,经检定各项指标均达到WHO和《中国药典》三部(2005版)的相关质量要求.本文对密切接触狂犬病患儿的医护人员,应用人用狂犬病疫苗进行接种,观察其免疫效果,现将结果报道如下.
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利用转基因植物表达肿瘤治疗相关蛋白
植物基因工程的诞生使得植物成为了一个高效的宿主生物反应器,可用来生产各种异源蛋白.近年来,利用植物生产各种药用蛋白的研究越来越引人注目,比如用于治疗肿瘤及癌症的蛋白.传统的药用蛋白生产方式成本高、产量小,远远不能满足人们的需要.利用植物基因工程方法培育的转基因植物为解决这一问题带来了希望.本文综述了一些与癌症及肿瘤治疗作用相关的蛋白在植物体内表达情况的研究进展.
