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微小RNA-221／222海绵体载体的构建及验证
目的：构建微小RNA（miR）-221／222海绵体载体并初步探讨其在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中的作用。方法利用miRNA海绵体技术设计合成含3个has-miR-221和3个has-miR-222反义序列的DNA片段，经酶切连入pDC316-mCMV-EGFP质粒载体，合成miR-221／222海绵体载体。将miR-221／222海绵体载体转染入OSCC细胞系UM1，检测转染效率，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测miR-221和miR-222表达水平，Western blot检测转染后PTEN蛋白表达水平，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建miR-221／222海绵体载体，测序验证与设计序列完全一致；UM1各组细胞转染效率均在70％以上；实时荧光定量PCR显示，miR-221／222海绵体载体组miR-221和miR-222表达水平较pDC316质粒组和UM1细胞组明显降低（t1=111.69，P1=0.001；t2=6.98，P2=0.002；t3=236.55，P3=0.001；t4=22.06，P4=0.001）；Western blot显示，海绵体转染组较对照组PTEN蛋白水平表达明显升高；Transwell实验显示，海绵体转染组细胞侵袭能力较对照组减弱。结论实验成功构建了miR-221／222海绵体载体，并初步验证其对OSCC细胞侵袭性的抑制作用，为后续miR-221／222的功能研究奠定基础。
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PTEN调节神经样细胞微管相关蛋白tau的聚集及意义
目的：观察体外诱导成人骨髓基质干细胞（BMSC）向神经细胞分化过程中，在第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）调节细胞骨架中轴突标志分子微管相关蛋白tau（MAPT）分布及聚集的特征，并探讨其意义。方法从成人骨髓中分离基质干细胞，在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞，将未分化的BMSC作为对照组；应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法研究MAPT的表达变化；经PTEN抑制剂BPV作用于该细胞后，用结合有荧光剂的鬼笔环肽直接染色细胞微丝肌动蛋白，并联合用免疫荧光细胞化学方法染色MAPT，在激光共聚焦显微镜下观察MAPT和肌动蛋白的定位及关联性。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后，MAPT的mRNA在分化1周和2周时相对表达水平为0.24±0.04和0.52±0.04，高于对照组BMSC的0.04±0.02（P＜0.05）。MAPT蛋白表达水平分别为0.18±0.03和0.44±0.05，高于对照组0.06±0.04（P＜0.05）。细胞染色后，经BPV作用后MAPT由弥散状态变为聚集状态，并分布于细胞一侧，神经样细胞开始出现极性。结论 BMSC来源的神经细胞分化成熟时，PTEN参与调节细胞骨架中轴突标志分子MAPT的转运和聚集，为神经细胞的轴突进一步生长提供物质支持。
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Survivin和第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因基因在肝癌组织中的表达及其相关性
目的 探讨Survivin和第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)及其编码蛋白在原发性肝细胞癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭、转移的相关性.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术及免疫组织化学染色法检测32例肝癌组织和对应的癌旁组织中Survivin和PTEN基因mRNA及蛋白的表达,并分析两者与肝癌临床病理因素的关系.结果 Survivin mRNA在原发性肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达率分别为68.75％和3.13％,差异有统计学意义(P＜0.05).Survivin mRNA及蛋白在低分化肝癌组织、肿瘤直径＞5 cm和有癌栓形成者中均明显增高(均P＜ 0.05).PTEN mRNA及蛋白在癌组织中表达率为43.75％,低于癌旁组织的87.50％ (P ＜0.05),其在低分化、肿瘤直径＞5 cm及有癌栓形成患者肝癌组织中的表达率分别为27.80％、31.60％、28.60％,均明显低于对应组的64.30％、61.50％、55.60％ (P＜ 0.05)；Survivin mRNA及蛋白表达与PTEN mRNA及蛋白表达呈负相关(P＜0.05).结论 Survivin和PTEN表达与原发性肝细胞癌浸润转移密切相关,且两者的表达呈负相关.
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第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因对人前列腺癌细胞株PC-3转移及基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达的影响
目的 观察第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)对人前列腺癌细胞株PC-3转移及基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响.方法 以携带野生型PTEN基因的腺病毒感染体外培养的PC-3细胞,采用间接免疫荧光实验和Western blot实验检测PTEN、MMP-2 、MMP-9蛋白表达的变化;明胶酶谱实验检测MMP-2和MMP-9酶活性的变化.划痕实验和Transwell实验检测PTEN对PC-3细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果 Ad-PTEN感染后PC-3细胞中PTEN表达明显增加,而MMP-2和MMP-9表达水平及活性均降低.划痕实验显示Ad-PTEN组细胞迁移距离在12h为(112.36±18.38) μm,明显少于Ad-LacZ组的(166.52±19.28) μm(t=4.55,P ＜0.01);在24 h为(214.75±35.62) μm,明显少于Ad-LacZ组的(361.87 ±46.15) μm(t=5.64,P ＜0.01);在48 h为(436.61 ±52.69) μm,明显少于Ad-LacZ组的(732.56±78.30) μm,(t=7.01,P＜0.01).Transwell实验结果显示Ad-PTEN组穿入下室面的细胞数[(22.40±2.41)个]明显少于Control组[(38.20±4.44)个,t=6.99,P＜0.01]及Ad-LacZ组[(37.20±4.97)个,t=5.98,P＜0.01].结论 PTEN对人前列腺癌PC-3细胞株转移及MMP-2、MMP-9表达有明显抑制作用,提示PTEN可能在前列腺癌的转移中发挥重要作用.
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微小RNA-221对肝细胞癌第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因的调节及其对生物学特性的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-221在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达,检测miR-221在正常肝组织和肝癌组织中的表达,并干预肝癌细胞中miR-221水平探讨其对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)的调控和对肝癌细胞生物学特性的影响.方法 采用实时定量聚合酶链反应法检测miR-221在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达,收集28例伴有门静脉癌栓的肝细胞癌手术患者正常肝组织、癌栓、癌组织和癌旁组织并检测其表达;采用miR-221抑制剂(inhibitor)和拟似物(mimic)靶向干预miR-221在肝癌细胞中的表达,Western blot法检测其对PTEN的调控,以及细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞仪和Transwell法检测其对肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响.结果 肝癌HepG2、BEL-7402和Hep3B细胞的miR-221相对表达量分别为0.783±0.021、0.954 ±0.021、0.837±0.026,显著高于正常肝L02细胞的0.081±0.007(P ＜0.05),且肝癌组织和癌栓的相对表达量为0.897±0.048、0.984±0.048,亦显著高于正常肝组织和癌旁组织的0.067±0.007、0.063 ±0.008(P ＜0.05),而肝癌细胞的PTEN的表达水平显著低于正常肝细胞(P＜0.05),且肝癌组织和癌栓亦低于正常肝细胞(P＜0.05);与对照组比较,miR-221 inhibitor和mimic转染肝癌细胞后,PTEN表达水平分别上调和下调263％和32％ (P＜0.05),转染miR-221 inhibitor肝癌细胞的增殖和迁移活性降低,凋亡率增加(P＜0.05),而转染miR-221 mimic肝癌细胞则增殖和迁移活性增加,凋亡率降低(P＜0.05).结论 肝癌细胞和肝癌组织、癌栓中miR-221呈高表达,降低其水平能上调PTEN的表达,有效降低细胞增殖和迁移活性,诱导细胞凋亡,是肝细胞癌的潜在治疗靶点.
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第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因/雷帕霉素靶蛋白调节细胞骨架构建在神经细胞分化过程中的变化及意义
目的 观察在体外诱导成人骨髓基质干细胞向神经细胞分化过程中,第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)调节细胞骨架构建的变化特征,并探讨其意义.方法 从成人骨髓中分离基质干细胞,在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞；应用PTEN抑制剂BPV作用于该细胞,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究PTEN下游信号分子mTOR的表达变化；应用结合有荧光剂的鬼笔环肽染色细胞骨架,在荧光显微镜下观察细胞突起内细胞骨架的变化特征及测量细胞突起长度.结果 成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后,神经细胞特征性标志分子神经元特异性烯醇化酶(NSE)和β-Ⅲ微管蛋白(tubulin)表达水平增加,而神经干细胞的标志物巢蛋白表达先增加后减少(P＜0.05)；经BPV作用后mTOR的表达水平高于作用前(P＜0.05)；细胞突起生长的长度从(4.58±1.21) μm增加到(9.09 ±2.68) μm(P ＜0.05).结论 BMSCs来源的神经细胞分化成熟时,PTEN/mTOR具有调节神经细胞突起内细胞骨架构建的能力.
