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乙型肝炎患者EBV转化B淋巴母细胞系的建立及其特点
为研究乙型肝炎患者EBV转化的B淋巴母细胞系的特征,并为进一步研究乙型肝炎患者细胞免疫功能奠定基础.采用丁酸钠诱导B95-8细胞产生高滴度EBV,并感染A(ATL比正常升高2倍)、B(ATL正常)两组乙型肝炎患者外周血单个核细胞.结果表明,EBV感染后4～8周,建立了19例乙型肝炎患者的永生化B淋巴母细胞系,A组患者的B细胞形成集落的时间明显晚于B组2～3周;细胞系冻存复苏后,活性良好:分别有88.34%和37.48%的永生化B细胞膜上表达CD19和CD20;永生化的B细胞中检测不到HBV DNA.提示乙型肝炎患者永生化B淋巴母细胞系的建立时间与患者免疫状态有关;B细胞永生化后,HBV DNA不能在细胞内持续存在,并终丢失.
关键词： 肝炎病毒 乙型 Epstein-Barr病毒 B淋巴母细胞系 -
乙型肝炎病毒感染者B淋巴母细胞系的建立
目的 在体外建立HBV感染者永生化的B淋巴母细胞系(LCL),并鉴定其HLA-A基因亚型.方法 利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞使之永生化,用环胞菌素A(Cys A)抑制血液中T淋巴细胞的活性;用PCR-SSP法检测血样本的HLA-A基因亚型.结果 成功建立了HBV感染者的永生细胞株16株,其中急性乙肝4例,慢性乙肝10例,携带者2例.所有的细胞株冻存后复苏的成功率为100%.细胞株的HLA-A基因亚型包括1101、0201、0101、2403等.结论 转化后的LCL保持了良好的稳定性,既可能作为人源单抗的来源,也可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞.永生化细胞HLA-A基因亚型的鉴定有可能使其成为异体相应亚型体外特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞.
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094 EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用
EBV转化B淋巴细胞后,形成永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL).B-LCL在体外能无限增殖,广泛应用于医学生物学研究领域.本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B-LCL应注意的问题以及B-LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述.
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人B淋巴母细胞系体外培养方法的优化及其影响因素
目的 探讨体外建立健康人外周血B淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)的优化方法及其影响因素.方法 用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CD40激发型抗体(5C11)、CpG DNA免疫调节基因序列以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性.光学显微镜下观察B-LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析B-LCLs膜表面分子CD19的表达水平.结果 PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B-LCk.转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养.CD40激发型抗体(5C11)及CpG免疫调节基因序列联合EBV感染人PBMC,明显地提高了转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征.结论 CD40信号激发和CpG免疫调节基凶序列联合运用能有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系.
关键词： EB病毒 CpG免疫调节基因序列 CD40信号 B淋巴母细胞系 -
肾综合征出血热患者B淋巴母细胞系的建立方法及意义
目的:探讨EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞的佳方法,为进一步研究肾综合征出血热(HFRS)患者的细胞免疫功能奠定基础. 方法:采用环孢素A(CsA)法、微量全血法和冻存全血法三种方法建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL),比较建立细胞系成功率和所用时间. 结果:EBV成功转化后的B-LCL,其体积增大并永生化,进而增生的淋巴细胞积聚成团.CsA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为73.3%、26.7%和46.7%. 结论:CsA法成功率高,建立细胞系所用时间短,是建立B-LCL的佳选择.
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原发性免疫缺陷病患者B淋巴母细胞系的建立及其核型检测
目的 体外建立原发性免疫缺陷病(PIDD)患者永生化B淋巴母细胞系(B-LCL),为进一步开展PIDD相关研究提供资源.方法 自PIDD患者外周血中分离单个核细胞,采用EB病毒感染并加入环胞菌素A抑制T淋巴细胞活性的方法建立B-LCL,7d左右倒置显微镜下观察转化细胞的形态,并进行染色体核型分析.结果 转化后的B淋巴母细胞体积增大,增生的淋巴细胞多聚集成团；已建立的永生化细胞能够成功冻存、复苏及传代；转化前后细胞染色体核型无明显改变.结论 本实验成功建立了PIDD患者永生化的B-LCL,为进一步开展PIDD的病因学研究及诊断、治疗奠定了基础.
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含HTNV S基因重组痘苗病毒在HFRS患者B淋巴母细胞系中的表达
采用Ficoll密度梯度离心法(淋巴细胞分离液)分离肾综合征出血热(HFRS)患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)感染B淋巴细胞,建立永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL).然后,用含汉滩病毒(Hantaan virus ,HTNV) S基因的重组痘苗病毒感染B-LCL,应用间接免疫荧光检测核衣壳蛋白的表达.结果表明,B淋巴细胞经EBV感染4周左右,可形成永生化B-LCL.成功转化后的B-LCL,体积增大,且增殖的淋巴细胞积聚成团.汉滩病毒S基因在B-LCL中能有效表达核衣壳蛋白.含S基因的重组痘苗病毒感染的B-LCL可用作HTNV核衣壳蛋白特异性CTL活性研究的靶细胞.
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肾综合征出血热患者永生化B淋巴母细胞系的建立
目的建立肾综合征出血热患者永生化的B淋巴母细胞系,为进一步研究汉滩病毒感染者的细胞免疫功能奠定基础.方法自HFRS患者血液中分离外周血单个核细胞(PBMC),再用EB病毒感染PBMC,同时加入环胞素A(CysA).结果 20例血样标本经EBV感染4周左右,形成了15例永生化B淋巴母细胞系.成功转化后的B淋巴母细胞系,其体积增大,进而增殖的淋巴细胞积聚成团.结论永生化的B淋巴母细胞系可传代培养.冻存复苏后细胞增殖活性并无改变.
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CpG基序联合EB病毒建立永生化B淋巴母细胞系
目的 体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCLs).方法 用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性.光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19和CD23的表达水平.结果 46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%.转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养.结论 CpG免疫调节基序联合EBV感染人PBMC,提高转化效率,转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞.
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EBV转化慢性乙型肝炎患者B淋巴母细胞系的建立
目的:体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCL).方法:用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性.光学显微镜下观察LCL的形态特征,利用流式细胞术分析LCL细胞膜表面分子CD19和CD23的表达水平.结果:46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%.转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养.结论:转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞.
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定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达
目的:构建携带V60, G87, L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60, G87, L97位置进行突变(p3.8Ⅱ- V60, G87, L97),转化E. coli XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切, 插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60, 87, 97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV 抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达.
