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钙释放通道稳定蛋白基因转染对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响
目的 探讨钙释放通道稳定蛋白FKBP12.6基因转染对心力衰竭心室肌细胞收缩功能的影响.方法 建立大鼠心力衰竭模型,采用酶解分离技术分离心室肌细胞,正常对照组用Ad-GFP感染正常心室肌细胞,Ad-FKBP12.6-GFP组用携带FKBP12.6基因的重组腺病毒Ad-FKBP12.6-GFP感染心力衰竭心室肌细胞,Ad-GFP组用Ad-GFP感染心力衰竭心室肌细胞.通过RT-PCR和Western blotting技术检测转基因的表达;在局部场刺激条件下,激光共聚焦线扫描检测心肌细胞内的钙瞬变,采用激光共聚焦面扫描测量心肌细胞舒张期末和收缩期末长度,以评价心肌细胞的收缩功能.结果 Ad-FKBP12.6-GFP组的FKBP12.6 mRNA和蛋白表达水平(分别为2.48±0.08,0.94±0.11)显著高于正常对照组(分别为0.96±0.12,0.48±0.07,P＜0.01)、Ad-GFP组(分别为0.47±0.08,0.25±0.04,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组;Ad-FKBP12.6-GFP组的钙瞬变幅度(F/F0峰值,3.16±0.42)显著高于正常对照组(2.14±0.41,P＜0.05)、Ad-GFP组(1.43±0.38,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组(P＜0.05);AdFKBP12.6-GFP组心室肌细胞收缩分数(9.36%±1.78%)显著高于正常对照组(8.17%±3.74%,P＜0.05)、Ad-GFP组(5.24%±1.25%,P＜0.01),且正常对照组显著高于Ad-GFP组(P＜0.01).结论 FKBP12.6基因转染改善了心力衰竭大鼠心室肌细胞的收缩功能,上调FKBP12.6的表达可能是心力衰竭治疗的一条新途径.
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FKBP12/12.6调控心肌兰尼碱受体的研究进展
某些心血管疾病如心律失常、心力衰竭等与心肌肌浆网兰尼碱受体2(RyR2)功能密切相关.FKBP12/12.6作为RyR2的关键调控蛋白,在稳定RyR2的结构及维持其功能的过程中具有重要作用.通过修复FKBP12/12.6与RyR2之间的相互作用可以改善RyR2功能,达到治疗作用.针对不同发病机制,靶向修复FKBP12/12.6与RyR2之间的相互作用,将成为未来治疗心血管疾病的重要突破点.
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CPU0213对内皮素-NADPH氧化酶介导H2O2损伤心肌细胞的改善作用
心肌细胞中NADPH氧化酶活性增强和内皮素系统过度激活,是造成心肌细胞损伤的重要机制.本文旨在探讨内皮素受体拮抗剂CPU0213能否通过抑制ET-NADPH氧化酶的过表达,减轻心肌细胞氧化损伤.将SD乳大鼠心肌细胞分成7组:对照组、H2O2组、PKA/PKC阻断剂H89/Bis干预组、,NADPH氧化酶阻断剂APO/DPI组和CPU0213治疗组.结果表明,H2 O2组钙调蛋白FKBP12.6,SERCA2a和CASQ2表达明显下调,pPKCε/PKCε,NADPH氧化酶亚基及ETA R/ETBR明显上调,提示:H2O2激活NADPH氧化酶须依赖PKC活性,CPU0213通过抑制ET-pPKC-NADPH氧化酶通路逆转FKBP12.6,SERCA2a和CASQ2的下调.
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FK506结合蛋白12.6基因转染对心力衰竭心室肌细胞钙通道和钠-钙交换器电流的影响
目的 探讨钙释放通道稳定蛋白FK506结合蛋白12.6(FKBP12.6)基因转染对心力衰竭(简称心衰)心室肌细胞钙通道(ICaL)和钠-钙交换电流(INCX)的影响.方法 用携带FKBP12.6基因的重组腺病毒Ad.FKBP12.6-GFP感染分离的心衰心室肌细胞,通过免疫荧光及激光共聚焦技术检测转基因的表达;采用全细胞膜片钳技术记录ICaL和INCX.结果 ①心衰心室肌细胞的FKBP12.6蛋白表达显著下调,Ad.FKBP12.6-GFP感染细胞的FKBP12.6蛋白表达水平显著高于Ad.GFP感染细胞;②Ad.GFP组心室肌细胞的ICaL密度峰值较正常对照组显著降低(6.81±0.83 pA/pF vs 11.43±1.14 pA/pF, P<0.01), 而FKBP12.6基因转染细胞电流密度峰值较Ad.GFP 组显著升高(9.60±1.09 pA/pF vs 6.81±0.83 pA/pF, P<0.01);③Ad.GFP组心室肌细胞的INCX较正常对照组明显升高(P<0.01),FKBP12.6基因转染使心衰心室肌细胞的INCX显著降低(P<0.05).结论 FKBP12.6基因转染显著升高心衰心室肌细胞ICaL,并显著降低INCX,从而逆转心衰时上述离子通道电流的改变.
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pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增
目的 构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体.方法 目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-T easy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因.连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行peDNA3.1-FKBP12.6的扩增.结果 成功构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体.结论 pCDNA3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径.
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FKBP12.6重组腺病毒载体的构建及其心肌细胞感染效率测定
[目的]构建携带FKBP12.6基因的重组腺病毒载体以研究FKBP12.6在心力衰竭时心室肌电重构中的作用.[方法]将平端化的FKBP12.6片段连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV构建重组穿梭质粒pAdTraek/FKBP12.6,用Xho I单酶切进行鉴定.采用电穿孔法将线性化pAdTrack/FKBP12.6转化AdEasier-1细菌,产生重组腺病毒质粒pAdEasy-1/FKBP12.6.采用脂质体介导法用线性化pAdEasy-1/FKBP12.6转染293细胞,从病变的293细胞分离、纯化重组腺病毒Ad.FKBP12.6:采用PCR方法对其进行鉴定.用重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞,在荧光显微镜下计算GFP阳性细胞百分率.[结果]在病变293细胞的冻融上清中含有重组腺病毒Ad.FKBP12.6,其滴度为1.5×1012pfu/mL.当感染复数(MOI)为75时,感染效率可达100%.[结论]成功构建了携带FKBP12.6基因的重组腺病毒载体;Ad.FKBP12.6可高效感染乳鼠心肌细胞.本研究为进一步探讨FKBP12.6在心力衰竭时心室肌电重构中的作用奠定了基础.
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FKBP12.6基因转染对心衰犬心功能及心肌病理变化的影响
目的 探讨白蛋白微泡介导的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染对心衰犬心功能及心肌病理变化的影响.方法 28只快速起搏心衰犬分为2组.转染组以白蛋白微泡为载体,在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染入心肌,以不含质粒的微泡作为对照组.两组又分为转染后4 d(转染Ⅰ组)和14 d(转染Ⅱ组).分别在起搏器安置前、转染前、转染后,采用超声测量左室内径、心功能评价FKBP12.6基因对心衰的治疗效果.通过HE染色和透射电镜观察心肌病理变化.应用RT-PCR检测各组FKBP12.6基因的表达情况.结果 超声微泡介导的转染可以提高心肌FKBP12.6 mRNA的表达.心肌病理显示转染组病变轻于对照组,而且未转染组病变进一步恶化.转染组EF、FS在第4天可见明显好转,并在14 d时保持稳定,但一直低于正常水平.在第4天时转染组LVEDD与对照组无变化,而LVEDV下降(P=0.04),在14 d时两指标与对照组比较均缩小(LVEDD和LVEDV的P值分别为0.012和0.005).结论 通过超声微泡介导转染FKBP12.6基因可以改善心脏功能,逆转心肌重塑,减轻心肌病理变化.
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FKBP12.6与RyR2的关系及其在心脏疾病中的意义
FKBP12.6从RyR2解离导致通道构象及功能改变.Ca2+从SR漏出使SR的Ca2+负荷减少,Ca2+瞬变减少,舒缩时RyR2耦联障碍,终引起心肌功能异常.而且RyR2对CICR敏感性提高导致心肌迟后去极诱发心律失常.通过过表达或增加FKBP12.6对RyR2亲和力可以改善通道缺陷,从而使心脏功能及心律失常得到改善.
