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不同核糖开关对下游靶基因调控效能的对比研究
目的 比对分属于激活和抑制型中的不同核糖开关的调控功效,为实现基因电路的精准调控奠定基础.方法 构建不同核糖开关(addA与M6,TPP与btuB)调控的绿色荧光蛋白amcyan表达载体,通过荧光表达量、RT-qPCR分析在不同配体物浓度调控下的amcyan表达,与未含核糖开关载体的表达量进行比较,进行动态调控效能分析.结果 在addA与M6激活型核糖开关的调控下,随配体物浓度的增加,绿色荧光表达量增加,且相比M6核糖开关,addA核糖开关拥有更大的动态调控效能;相反,在TPP与btuB抑制型核糖开关的调控下,随配体物浓度的增加,绿色荧光表达量减少,但btuB核糖开关的动态调控效能略大于TPP核糖开关.结论 相同作用机制的不同核糖开关调控功效存在差异,拥有动态调控效能优势的激活型开关addA与抑制型开关btuB更适合在大肠杆菌中用于代谢精确调控与靶基因精准表达.
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放射诱导同步放大基因电路调控HSV-TK表达对肺癌移植瘤的抑制作用
目的 构建由放射诱导的一氧化氮(NO)同步放大基因电路,并利用该基因电路调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)表达,以研究该基因电路对肺癌细胞体内的治疗作用. 方法 利用分子克隆的方法构建重组治疗载体pfos-iNOS/TK和对照载体pfos-TK/GFP,并采用脂质体介导重组治疗载体和对照载体转染肺癌细胞A549;G418筛选阳性克隆;建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,检测接受照射和未接受照射的瘤组织内TK表达情况,分析给予照射和更昔洛韦(GCV)后肿瘤体积的变化. 结果 接受照射的瘤组织内TK表达明显强于未接受照射组,接受照射的转染治疗载体组强于接受照射的转染对照载体组,放射合并GCV可明显抑制转染治疗载体的移植瘤,且抑瘤率明显高于单纯照射、GCV治疗和转染对照载体的对照组. 结论 放射诱导的同步放大基因电路可明显提高体内转染细胞TK的表达,对肺癌移植瘤有显著的抑制作用,明显地提高了HSV-TK/GCV系统对肺癌细胞的敏感性,进一步完善了肿瘤的放射-基因治疗模式.
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基因电路研究进展
将不同基因按一定规则连接在一起即构成基因电路(genetic circuits),上游基因的蛋白产物调控下游基因的表达活性,环环相扣,从而完成特定的生物学功能.基因电路构成的基本原理是各种逻辑门(logic gate),基本的两个逻辑门是"变极器"和"AND",在此基础上可构成各种复杂的基因电路.BioSPICE软件是目前常用的一种基因电路设计程序,但其尚需进一步完善."定向进化"(directed evolution)法是新近提出的一种基因电路设计方法.基因电路在未来的肿瘤诊治中将发挥重要作用.
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基因电路研究现状及面临的问题
将不同基因按一定规则连接在一起即构成基因电路(Genetic circuits),上游基因的蛋白产物调控下游基因的表达活性,环环相扣,从而完成特定的生物学功能.通过构建基因逻辑电路并导入细胞,可以扩展和修饰细胞行为.迄今已构建了自抑制子(Autorepressor)、套环开关(Toggle-switch)、振动子(Oscillator)等原型基因电路.目前主要采用推理法和定向进化法设计和验证基因电路.类似目前的计算机编程,将来我们可随意设计细胞行为.
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放射诱导的一氧化氮同步放大基因电路的构建及鉴定
背景与目的 正反馈基因电路(gene circuits)对基因表达有放大作用,目的基因在细胞内的同步化表达可进一步增强基因治疗效果.本研究旨在构建由放射诱导的一氧化氮(nitric oxide,NO)同步放大基因电路,以探索提高目的基因表达水平、延长表达时间的新途径,从而进一步完善肿瘤放射基因治疗模式.方法 将具有放射诱导性的c-fos启动子与诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)串联,构建c-fos启动子驱动的iNOS和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双顺反子表达载体pfosiNOS/GFP用脂质体介导该载体转染肺腺癌A549细胞,予以一定剂量照射,观察照射后不同时相点细胞荧光强度,检测iNOS蛋白表达水平.结果 转染载体pfos-iNOS/GFP的细胞照射后细胞荧光强度、iNOS表达水平均较对照组明显增加,其中以照射后16 h增加为明显.结论 成功构建了放射诱导的NO同步放大基因电路,大大提高了放射诱导的目的基因的表达水平,为进一步提高肿瘤放射基因治疗的疗效奠定了理论基础.
