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心肌缺血和低氧模型大鼠心肌组织琥珀酸受体表达的变化
目的 利用心肌缺血、低氧模型大鼠,检测大鼠心肌组织琥珀酸(盐)受体(GPR91)表达的变化,以分析心肌缺血、低氧与GPR91表达的关系.方法 分别制备大鼠冠状动脉结扎所致心肌缺血模型、模拟高原环境所致心肌低氧模型.前者由结扎大鼠心脏左冠脉前降支诱发,包括假手术组、左冠脉结扎12 h组和24 h组,每组6只,记录各组大鼠心电图,以氯化三苯基四氮唑染色法显示心肌组织梗死程度并计算梗死比例,自动生化分析仪检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及心肌肌钙蛋白T(cTn-T)的含量变化,对制备模型加以鉴定;后者利用专用低压舱模拟高原低氧环境诱发,设正常气压组、低气压环境生存1、3、5和7d组,每组6只,检测大鼠血清中LDH、CK及cTn-T含量的变化.分别以实时荧光定量PCR法和Western印迹法,检测上述各组大鼠心肌组织GPR91 mRNA和蛋白的表达水平,每组动物检测3只.结果 与假手术组大鼠比较,冠脉结扎12和24 h组大鼠的心电图均表现为ST段弓背型抬高,心肌梗死面积比例分别为(23.18±3.46)％及(34.85±2.22)％(P<0.05),血清中LDH、CK及cTn-T的含量均明显增加(P<0.01);与正常气压组比较,低压环境生存1、3、5和7 d组大鼠血清LDH、CK及cTn-T的含量升高明显(P<0.01).GPR91表达检测结果显示,冠脉结扎12、24 h组大鼠心肌组织mRNA和蛋白水平均出现上调(vs假手术组,P<0.01、P<0.05);低压1、3、5和7 d组大鼠心肌GPR91的mRNA表达明显增加(vs正常气压组,P<0.05),其蛋白表达增加以7 d组为明显(vs正常气压组,P<0.05).结论 大鼠心肌在缺血、低氧过程中,反映心肌组织受损的血清学指标LDH、CK及cTn-T含量明显增加,与此同时,心肌组织GPR91的mRNA及蛋白表达显著上调.提示GPR91具有心肌缺血、低氧防治的潜在靶点意义.
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CHO-hGPR91工程细胞株的构建及鉴定
目的 构建携带hGPR91蛋白表达序列的pcDNA3.1(+)-hGPR91表达载体,并将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中,经筛选获得CHO-hGPR91工程细胞株,并对工程细胞株表达受体功能进行初步鉴定.方法 采用PCR法扩增hGPR91全长开放阅读框,通过T4连接酶将其连接到载体pcDNA3.1(+)上,再通过Lipofectamine 2000将重组载体转染入CHO细胞中,并以抗生素G418加压筛选,RT-PCR及Western印迹法检测工程细胞株中hGPR91 mRNA及蛋白的表达情况,以Fluo4-AM荧光染料检测琥珀酸对细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响.结果 所构建CHO-hGPR91工程细胞株能够成功表达hGPR91的mRNA及蛋白,在琥珀酸的刺激下能够明显引起工程细胞株[Ca2+]i的变化;而空载体pcDNA3.1(+)转染CHO细胞所得的CHO-pcDNA3.1(+)细胞则无上述效应.结论 成功构建了CHO-hGPR91工程细胞株,琥珀酸作为GPR91的特异性配体,能够明显改变工程细胞株的[Ca2+]i,为进一步研究GPR91的功能及针对以GPR91为靶点的药物研发奠定了基础.
