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野生型组织型纤溶酶原激活剂工程细胞株生物学特性分析
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是体内丝氨酸类蛋白酶.它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶,后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段,使血栓溶解,血管再通.而且由于它与纤维蛋白有高亲和力,只激活血栓表面纤溶酶原,溶解局部血栓,因而引起全身出血倾向小.目前,它已成为一种较好的溶栓药.本研究构建了重组t-PA并在CHO-dhfr-细胞中获得了高效表达.为满足应用的要求,作者对该细胞株进行了生物学特性分析,包括细胞形态、表达水平、细胞株稳定性、致瘤性、遗传特性以及是否被污染等.
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CHO-hGPR91工程细胞株的构建及鉴定
目的 构建携带hGPR91蛋白表达序列的pcDNA3.1(+)-hGPR91表达载体,并将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中,经筛选获得CHO-hGPR91工程细胞株,并对工程细胞株表达受体功能进行初步鉴定.方法 采用PCR法扩增hGPR91全长开放阅读框,通过T4连接酶将其连接到载体pcDNA3.1(+)上,再通过Lipofectamine 2000将重组载体转染入CHO细胞中,并以抗生素G418加压筛选,RT-PCR及Western印迹法检测工程细胞株中hGPR91 mRNA及蛋白的表达情况,以Fluo4-AM荧光染料检测琥珀酸对细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响.结果 所构建CHO-hGPR91工程细胞株能够成功表达hGPR91的mRNA及蛋白,在琥珀酸的刺激下能够明显引起工程细胞株[Ca2+]i的变化;而空载体pcDNA3.1(+)转染CHO细胞所得的CHO-pcDNA3.1(+)细胞则无上述效应.结论 成功构建了CHO-hGPR91工程细胞株,琥珀酸作为GPR91的特异性配体,能够明显改变工程细胞株的[Ca2+]i,为进一步研究GPR91的功能及针对以GPR91为靶点的药物研发奠定了基础.
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高通量筛选JAK-STAT6信号传导通路抑制剂方法的初步建立
目的 构建可用于高通量筛选JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的工程细胞株,建立稳定可靠的筛选方法.方法 利用基因重组和转染技术,将STAT6特异性识别启动子IgE基因序列和虫荧光素酶报告基因联合插入pGMV质粒,脂质体法转染至HeLa细胞,经潮红霉素B抗性筛选及报告基因检测,得到稳定表达虫荧光素酶的工程细胞株.通过优化溶剂DMSO浓度,IL-4作用浓度及孵育时间等筛选条件,建立了可靠的筛选方法,并在此基础上对1600种化合物进行了筛选.结果 建立的筛选方法稳定可靠,系统Z'因子达到0.64.通过对1 600种化合物的筛选,得到3个抑制效果较理想的化合物并测得其IG50值.结论 所建立的高通量筛选方法可用于JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的筛选.
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人源受体hGPCRc工程细胞株的建立及其应用
目的建立孤儿G蛋白偶联受体(Orphan G protein-coupled receptors,oGPCRs)配基筛选体系并应用于化合物的筛选.方法利用RT-PCR从人结肠组织获得oGPCR成员hGPCRc的氨基酸编码序列,在利用相关软件对hGPCRc的结构特点进行分析的基础上,构建hGPCRc之表达载体pcDNA3.1(+)-hGPCRc,转染CHO-K1细胞获得CHO-hGPCRc工程细胞株,将不同化合物作用于细胞株,用Fluo-3为分子探针检测细胞内钙离子浓度变化,以分析化合物中是否为该受体的特异性配基.结果生物信息学分析得到:hGPCRc定位于人染色体13q32.2,对应的氨基酸序列组成了7个跨膜区段的结构域,在进化树上与人源P2Y1受体亲近,应属于人类GPCR成员;成功得到CHO-hGPCRc工程细胞株;所检测化合物作用于细胞株并没有引起胞内钙离子的波动,很可能没有活化hGPCRc.结论 hGPCRc是一个与已知人P2Y1近的成员,但基于CHO-hGPCRc工程细胞株的第二信使筛选结果表明,hGPCRc并不被P2Y1的已知配基活化,因此很可能属于不同于P2Y1的嘌呤类受体新亚型.
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反义RNA逆转耐药肝癌基因工程细胞株多药耐药性的实验研究
目的 通过重组腺病毒表达出mdr1基因的反义RNA,观察反义RNA对人肝癌基因工程细胞株HepG2/K多药耐药性的逆转效应.方法 利用真核表达载体构建可以稳定表达mdr1基因和P糖蛋白的肝癌基因工程细胞株HepG2/K,通过腺病毒载体AdEasy系统生成重组腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1,将此病毒感染HepG2/K,用KT-PCR检测mdr1 mRNA的表达强度,流式细胞仪检测细胞膜p-糖蛋白的表达和柔红霉素的蓄积率,HepG2/K细胞对阿霉素的耐药性用MTT法检测.结果 HepG2/R细胞感染重组腺病毒后,RT-PCK检测表明mdr1 mRNA表达下降,流式细胞仪检测证实P-gP表达下降和柔红霉素的蓄积率增加,MTT法表明HepG2/K细胞对阿霉素的IC_(50)从25μg/mL下降到3μg/mL.结论 反义RNA通过抑制mdr1 mRNA和P-gp的表达.
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肝癌多药耐药基因工程细胞的建立及特性分析
目的 利用转基因方法建立表达mdr1基因的肝癌基因工程细胞,为深入肝癌多药耐药现象研究提供理想的细胞模型.方法 构建表达mdr1cDNA全长序列的真核表达载体PCI/mdr1,利用脂质体将mdr1cDNA转染入人肝癌细胞株HepG2细胞,通过阿霉素短暂诱导和G418筛选转染阳性细胞,筛选出稳定表达mdr1及P-gp蛋白的细胞株HepG2/R.结果 HepG2/R细胞与出发株HepG2细胞相比较,MTT法检测生长曲线并无明显差异,对阿霉素和丝裂霉素的耐药性分别增加了35.7倍和125倍.KT-PCR检测HepG2/R细胞的mdr1 mRNA表达明显增加,流式细胞仪检测HepG2/R细胞P-gP的表达状况明显增加.结论 成功建立表达mdr1基因的肝癌工程细胞株.
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SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺中抗体基因稳定性
目的 采用SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺过程中工程细胞株抗体基因的稳定性.方法取灌注培养0、7、14、21、28、35 d的CHO细胞,用SYBR Green实时定量PCR分析其抗体基因稳定性.使用标准曲线相对定量法分析CHO细胞中β-肌动蛋白和抗体基因拷贝数,以抗体基因拷贝数与β-肌动蛋白基因拷贝数的比值表示工程细胞中抗体基因水平.结果 工程细胞株工作种子、发酵罐中不同时间点样品抗体基因拷贝数保持稳定,抗体基因拷贝数相对β-肌动蛋白基因为0.93±0.10,抗体基因相对含量与培养时间之间不相关( P = 0.938).结论抗体工程细胞株在灌注培养过程中抗体基因保持稳定.
关键词： SYBR Green 实时定量PCR 灌注培养 基因稳定性 工程细胞株
